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背景心肌梗死（Myocardial Infarction,AMI）是目前危害非常大的一种缺血性心脏疾病,目前常用的治疗方式是经皮冠状动脉介入治疗（percutaneous coronary intervention,PCI）。但是再灌注后,血管的突然开放会造成细胞钙离子超载与能量代谢的障碍,氧自由基的增多,以及心脏微血管的损伤,进一步加剧心肌细胞的死亡,这种损伤在临床中称为缺血再灌注损伤（Myocardial ischemia reperfusion injury,I/RI）。心脏中微血管主要包括微动脉,毛细血管和微静脉。微动脉（直径＜100μm）位于心室壁内,它们直接响应心肌对氧和营养物质的需求,并努力使心脏血流量与这一需求相匹配。心脏微血管内皮细胞（Cardiac Microvascular Endothelial Cells,CMECs）是心脏微血管的主要组成成分。在正常心脏中,几乎每一个心肌细胞旁都有毛细血管,心脏内皮细胞的数量是心肌细胞的3倍还多,但是心脏内皮细胞与心肌细胞体积（或质量）之比仅为0.04-0.05。最初发现,在再灌注时期,相比于心肌细胞,内皮细胞的凋亡更早。最近的研究表明,在I/R损伤时,血管内皮细胞（Endothelial Cells,ECs）通过分泌保护因子来减轻心肌细胞（Cardiomyocytes,CMs）的损伤。髓源性生长因子（Myeloid-derived growth factor,MYDGF）,是一种分泌型蛋白,有文献报道,在心肌梗死中,MYDGF可以保护心肌细胞免受缺血再灌注损伤。根据其氨基酸序列发现,MYDGF不属于任何已知的细胞因子或生长因子家族,与其他蛋白质没有序列同源性,并且也无特异性结构,MYDGF受体或介导这些效应的下游信号分子也尚不清楚。因此,对MYDGF结构的确定有助于更深入的了解其生物学功能。已证实,内皮细胞与心肌细胞之间的“对话”对心脏有保护作用,通过内皮细胞分泌的心脏保护因子来调控心肌细胞,可能是降低心肌细胞I/R损伤的替代治疗方案;但是,对于心脏微血管内皮细胞和心肌细胞之间的相互作用报道的还较少。同时,在现有的报道中MYDGF主要在骨髓来源的单核-巨噬细胞中表达,CMECs来源的MYDGF对心梗后心肌细胞的作用目前还不清楚。因此本课题拟在体外构建CMECs和CMs共培养模型,研究CMECs在I/R损伤中对心肌细胞的作用及机制,并进一步探究CMECs来源的MYDGF在心肌梗死后对心肌细胞的作用。目的探究在缺血再灌注损伤时,心脏微血管内皮细胞来源的MYDGF对心肌细胞的作用及具体机制,为治疗缺血再灌注损伤提供新的研究靶点。方法1.大鼠CMECs的分离与鉴定采用双酶消化的方法,分离大鼠左心室的微血管内皮细胞;利用免疫荧光和血管形成实验鉴定分离得到的CMECs。2.CMECs和CMs上清置换模型收集CMECs H/R后的条件培养基,将其转移至H9c2,检测H9c2 H/R后,上清中LDH的变化。3.CMECs和CMs共培养模型利用3 μm Transwell小室建立共培养模型,CMECs和H9c2共培养H/R后,TUNEL、流式细胞术检测下室H9c2的凋亡;Western Blotting检测下室H9c2凋亡相关蛋白的表达;qRT-PCR检测下室H9c2炎症相关因子的表达。4.蛋白组学测序收集CMECs H8R2后的上清,利用同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）技术,鉴定和分析上清中的差异蛋白。5.表达、纯化大鼠MYDGF重组蛋白构建pcDNA3.1-MYDGF-myc-His（-）B表达载体,转染293T细胞,表达、纯化大鼠MYDGF重组蛋白。6.构建大鼠心脏I1R24h模型,并给予重组MYDGF蛋白治疗,实验结束后,TTC染色,观察心脏梗死面积。7.利用AAV9在大鼠心脏过表达MYDGF,并建立I1R24模型,TTC染色、HE、TUNLE、qRT-PCR等检测心肌组织损伤。结果1.成功分离大鼠CMECs,鉴定结果显示其可用于后续实验。2.CMECs H/R后的上清可以降低H9c2 H/R后上清中LDH的含量。3.TUNEL和流式细胞术结果显示,CMECs和H9c2细胞共培养H/R后,H9c2的凋亡率明显下降。Western Blotting结果显示,CMECs和H9c2细胞共培养H/R后,H9c2中凋亡相关蛋白Bax和Cleaved-Caspase-3的表达明显下降。qRT-PCR结果显示,CMECs和H9c2细胞共培养H/R后,H9c2中炎症相关因子IL-6和IL-18的表达明显下降。4.iTRAQ结果显示,CMECs H/R后的上清中共鉴定出差异蛋白474个,其中上调蛋白169个,下调蛋白375个,进一步筛选出分泌型蛋白MYDGF,并在CMECs H/R后的上清中得到验证。5.重组 MYDGF 蛋白可以降低 H9c2 和 NRVM H8R2 后 Cleaved-Caspase-3、Bax 的表达,并且促进Akt的磷酸化。6.成功构建稳定表达大鼠MYDGF的质粒,运用真核表达系统成功获得MYDGF蛋白,并用镍柱进行纯化。7.大鼠I1R24时给予MYDGF蛋白治疗可以明显降低心脏梗死面积。8.成功构建AAV9-MYDGF的过表达大鼠,I1R24后,AAV9-MYDGF大鼠心脏损伤明显降低。结论1.CMECs在缺氧-复氧时可以减轻心肌细胞的损伤。2.CMECs在缺氧-复氧时MYDGF的表达量明显增加。3.在缺血再灌注时,CMECs来源的MYDGF通过激活心肌细胞的Akt信号通路,减轻心肌细胞凋亡,进而保护心脏免受缺血再灌注损伤。