论文部分内容阅读
硼是植物生长必需的微量元素,其适合植物生长的范围很窄,不当农艺措施或干旱易导致硼毒害现象,在干旱或半干旱地区还常伴随盐胁迫。干旱季节烟草种植过程中硼毒害和盐害也经常同时发生。硼毒害和盐胁迫的相互影响现象广泛存在,硼可以缓解盐胁迫,盐也可以缓解硼毒害,但是它们的影响机制还不是很清楚。本实验将萌发至8叶期的烟苗分别在含不同浓度硼的 Hoagland 培养液（50B（50μM H3BO3,对照）,2000B（2000μM H3BO3,高硼））中培养三周,而后将50B和2000B处理各一半材料的培养液中加入100mMNaCl（分别命名为 50B（50μM H3BO3,对照）,50BS（50μM H3B03+100mMNaCl,盐胁迫）,2000B（2000μM H3BO3,高硼）,2000BS（2000μM H3BO3+100mMNaCl,高硼加盐））培养一周,比较不同处理下烟草表型及生理指标差异,并利用RNA-Sequencing技术来探究盐胁迫缓解烟草叶片硼毒害的分子机制。处理后发现:与50B相比,2000B处理后叶长、叶宽、根长、根体积和根系面积显著降低,2000BS处理后指标都部分恢复。元素含量测定结果显示:和50B相比,50BS烟叶中K和P在含量降低且具有极显著性,2000B最高并有极显著性,2000BS也增加且有极显著性。2000B和2000BS中B含量无明显差异,但是都显著高于50B和50BS。B和P主要积累在叶片中,K主要积累在茎部,2000B促进P和K在烟叶中的积累,叶中K 比对照增加了 1.18倍,P比对照增加了 1.6倍。生理指标检测发现:与50B相比,2000B导致叶片中积累的H2O2含量最高,2000BS次之,50BS最后且均有显著性差异,表明盐处理能减轻硼毒害造成的过氧化氢伤害;与50B相比,2000BS时过氧化物酶（POD）活性最高,50BS次之,2000B最后且均有显著性差异。另外,50BS和2000BS分别与50B和2000B相比,叶绿素a和b均上升,表明了盐胁迫增加了烟草叶片的叶绿素含量;与50B相比,2000BS、50BS和2000B总糖含量依次降低且均具有显著性差异。2000BS处理升高了 2000B时果糖和葡萄糖的含量且有极显著性差异。2000BS比2000B处理下总糖、果糖和葡萄糖含量都高,表明了硼盐互作储存的能量物质高于单独的硼毒害,也说明了盐缓解硼毒害;蔗糖合成酶（SS）和蔗糖磷酸合成酶（SPS）活性检测显示:2000BS 比 2000B处理下蔗糖合成量高,给烟草植株提供能量也越多,一定程度上也说明为何硼盐互作时可以缓解硼毒害;与50B相比,50BS、2000BS和2000B纤维素含量依次降低,2000BS处理升高了 2000B时纤维素含量且具有极显著性差异;与50B相比,50BS果胶含量显著性增加,2000BS和2000B果胶含量依次下降且具有极显著性。为分析盐处理究竟通过哪些机制减轻了烟草的硼毒害,采用了高通量转录组测序技术,收集50B,50BS,2000B,2000BS处理后的叶片送出进行RNA-seq测序。将测序得到的显著性差异基因分别进行GO和KEGG的注释和功能分析,并应用STRING数据库进行蛋白网络互作关系分析。结果显示:特异性响应2000B处理的显著性差异基因有243个,特异性响应2000BS处理的显著性差异基因有204个,特异性响应50BS处理的显著性差异基因有1738个。这些差异基因主要影响植物病原菌互作,植物激素信号转导（脱落酸、赤霉素和细胞分裂素）,糖代谢,钙信号和过氧化氢信号等过程。2000B处理下烟草脱落酸（ABA）信号增强;海藻糖合成上升;抗逆和抗病以及防御信号增强。和2000B相比,2000BS中胞内钙离子浓度降低,钙信号减弱;脱落酸（ABA）信号响应减弱;细胞分裂素信号增强;活性赤霉素（GA）合成较多,降解较少,也就是硼盐互作中GA含量较高;降低了海藻糖和麦芽糖含量,增加了淀粉、果糖和葡萄糖的含量;产生的活性氧（ROS）较少且过氧化氢含量降低,由此也说明盐胁迫缓解了烟草的硼毒害现象。对部分差异基因进行了 mRNA表达水平分析,发现多数基因的表达水平和RNA-seq结果一致,与对照50B相比,50BS,2000B和2000BS与其测序结果相关系数R值分别为0.8913,0.8726和0.675。另外,对拟南芥幼苗进行同样的硼盐处理发现盐缓解了硼毒害导致的叶片白化现象。转录组学发现高硼处理下Tir基因下调,因此对拟南芥tir突变体和DR5进行不同浓度的硼处理发现tir突变体对高硼处理不敏感。拟南芥DR5幼苗根尖的GUS染色结果显示:随着硼浓度的升高,根尖染色越来越浅,即生长素浓度越来越低,验证结果和组学是一致的。综上所述,与对照相比,高硼导致烟草叶片中的H2O2显著增加,激活了 ABA信号途径,增强了水杨酸和茉莉酸信号途径,抑制烟叶中的糖代谢途径,降低了总糖、果糖和葡萄糖含量,最终导致叶片生长抑制。与高硼相比,高硼加盐处理下叶片中H2O2含量显著降低,ABA和钙信号减弱,细胞分裂素信号途径和糖代谢增强,从而导致叶片中糖含量增加、叶片面积增大,缓解烟草硼毒害。