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第一部分骨关节炎小鼠软骨和软骨下骨的疾病表型目的:构建前交叉韧带切除(anterior cruciate ligament transection,ACLT)的小鼠骨关节炎(osteoarthritis,OA)模型。进行小鼠胫骨OA软骨和软骨下骨的组织学分析,观察其病理改变。材料与方法:8周龄C57BL/6J(雄性)行小鼠行前交叉韧带切断术。造模8周后膝关节标本,石蜡包埋,组织切片,行Alcian blue/hematoxylin&orange G(AB/H&OG)染色,显微镜拍照,行组织学OARSI评分。用计算机软件Image J计算胫骨软骨区域的面积。运用骨形态计量学软件Bioquant计算小鼠胫骨软骨下骨板的平均厚度。结果:造模8周后组织切片显示:(1)与假手术对照组相比,OA晚期小鼠胫骨透明软骨磨损严重,软骨下骨暴露。OA晚期小鼠胫骨软骨OARSI评分显著增高(P<0.01)。(2)与假手术对照组相比,OA晚期小鼠胫骨软骨面积显著减少(P<0.05)。(3)与假手术对照组相比,OA晚期小鼠胫骨软骨下骨板平均厚度明显增厚(P<0.05)。结论:该实验采用ACLT方法成功建立了小鼠膝关节OA模型,OA晚期胫骨软骨缺损严重,软骨下骨暴露,软骨下骨板增厚。造模后8周内的病理形态学改变类似于人类膝关节晚期OA表现。第二部分骨关节炎小鼠软骨下骨骨髓间充质干细胞的疾病表型目的:构建小鼠OA模型,取小鼠胫骨上端标本,分离骨髓间充质干细胞(Bone Marrow stromal Cells,BMSCs),进行体外培养,检测OA小鼠BMSCs成骨分化能力、矿化能力以及分泌胶原蛋白的能力。材料与方法:8周龄C57BL/6J小鼠(雄性)行前交叉韧带切断术。造模8周后,分离骨髓间充质干细胞BMSCs:(1)细胞接种于培养皿中,体外成骨诱导21天,行茜素红染色,镜下拍照后,将茜素红洗脱行分光光度计检测,评价其矿化能力;(2)流式细胞术检测BMSCS中Nestin和Osterix阳性细胞的比例;(3)分别提取总RNA和总蛋白,定量RT-PCR和western blot检测Col1A1和Col1A2的m RNA和蛋白质的表达量,并计算二者的比值。(4)收取膝关节标本,制作石蜡切片,免疫组化检测Nestin和Osterix的表达。结果:(1)与假手术对照组相比,OA小鼠BMSCs标志基因Nestin和Osterix表达显著增多(P<0.05)。(2)与假手术对照组相比,OA小鼠BMSCs茜素红染色的矿化骨结节数目显著下降(P<0.05)。(3)与假手术对照组相比,OA小鼠BMSCS诱导后Col1A1和Col1A2的m RNA和蛋白质的表达量显著增高(P<0.05);二者的比值也显著增高(P<0.05)。结论:在小鼠晚期OA模型中:(1)OA小鼠胫骨软骨下骨BMSCs中Nestin和Osterix表达增高。(2)OA小鼠胫骨软骨下骨BMSCs和前成骨细胞的数量显著升高。(3)OA小鼠胫骨软骨下骨BMSCs的矿化能力减弱。(4)OA小鼠胫骨软骨下骨BMSCs I型胶原合成能力增强,但Col1A1/Col1A2比例增高,软骨下骨矿化功能减弱。第三部分IL-6在骨关节炎小鼠软骨下骨疾病表型建立中的作用目的:检测IL-6在OA小鼠胫骨软骨下骨BMSCs中的表达情况,并通过抑制IL-6/STAT3信号,观察其对骨关节炎小鼠软骨下骨BMSCs成骨分化的影响。材料与方法:8周龄雄性C57BL/6J小鼠行前交叉韧带切断术。于术后第8周收集小鼠胫骨近端软骨下骨,分离其中的BMScs:(1)收取小鼠膝关节,制作石蜡切片,针对IL-6和p-STAT3进行免疫组化染色,显微镜下拍照;(2)提取总RNA和总蛋白,利用定量RT-PCR,Western-blot和ELISA检测细胞中的IL-6和p-STAT3的m RNA和蛋白质表达水平;(3)进行体外培养,用BMP-2诱导细胞矿化,向培养基中分别加入IL-6中和抗体(对照Ig G),IL-6 si RNA(对照Scamble),STAT3的抑制剂AG490(对照Vehicle),4周之后行茜素红(矿化骨结节)染色,显微镜下拍照,之后将茜素红洗脱,分光光度计定量;(4)进行体外培养,用BMP-2诱导细胞矿化,向培养基中分别加入IL-6中和抗体(对照Ig G),IL-6 si RNA(对照Scamble),STAT3的抑制剂AG490(对照Vehicle),4周之后提取m RNA,用定量PCR检测Col1A1和Col1A2的m RNA的表达量,并计算二者的比值。(5)进行体外培养,用BMP-2诱导细胞矿化,向培养基中分别加入IL-6中和抗体(对照Ig G),IL-6 si RNA(对照Scamble),STAT3的抑制剂AG490(对照Vehicle),4周之后提取总蛋白,用western blot检测Col1A1和Col1A2的蛋白质的表达量,并计算二者的比值。结果:(1)与假手术组相比,骨关节炎组小鼠膝关节胫骨软骨下骨骨髓间充质干细胞IL-6和磷酸化STAT3的表达水平显著升高。(2)通过中和抗体和RNA干扰下调IL-6,以及AG490抑制STAT3,均能够提高骨关节炎小鼠软骨下骨骨髓基质细胞的体外矿化能力。(3)通过中和抗体和RNA干扰下调IL-6,以及AG490抑制STAT3,均能够降低骨关节炎小鼠软骨下骨骨髓间充质干细胞I型胶原1A1/1A2的比值(m RNA和蛋白水平)。结论:(1)骨关节炎小鼠软骨下骨骨髓间充质干细胞IL-6和磷酸化STAT3的表达水平显著提高。(2)过度激活的IL-6/STAT3信号与骨关节炎小鼠软骨下骨骨髓间充质干细胞体外矿化能力减弱有关。(3)过度激活的IL-6/STAT3信号与骨关节炎小鼠软骨下骨骨髓间充质干细胞体外I型胶原分泌异常有关。第四部分阻断IL-6/STAT3对骨关节炎小鼠软骨和软骨下骨的保护作用目的:通过腹腔注射IL-6中和抗体或AG490,检测阻断IL-6/STAT3通路对小鼠胫骨软骨下骨的保护作用。材料与方法:8周龄雄性C57BL/6J小鼠行前交叉韧带切断术,于术后开始将腹腔注射IL-6中和抗体(Ig G对照,每周一次)或AG490(DMSO对照,每天一次)。于术后第8周,收集小鼠胫骨近端软骨下骨,石蜡包埋切片,Alcian blue/hematoxylin&orange G(AB/H&OG)染色,于显微镜下拍照,进行胫骨软骨和软骨下骨的OARSI评分。用计算机软件Image J计算胫骨软骨区域的面积。运用骨形态计量学软件Bioquant计算小鼠胫骨软骨下骨板的平均厚度。对Nestin和Osterix进行免疫组化染色,显微镜下拍照。另一部分软骨下骨分离MSCs,流式细胞术检测其中Nestin和Osterix阳性细胞的比例。结果:(1)切片形态学观察显示通过腹腔注射IL-6中和抗体或AG490,均能够较有效地保护骨关节炎小鼠膝关节胫骨被破坏的关节软骨。(2)通过腹腔注射IL-6中和抗体或AG490,均能够提高骨关节炎小鼠膝关节的OARSI评分。(3)通过腹腔注射IL-6中和抗体或AG490,均能够提高骨关节炎小鼠膝关节胫骨软骨面积。(4)通过腹腔注射IL-6中和抗体或AG490,均能够提高骨关节炎小鼠膝关节胫骨软骨下骨厚度。(5)通过腹腔注射IL-6中和抗体或AG490,均能够降低骨关节炎小鼠软骨下骨骨髓间充质干细胞和前成骨细胞的数量。结论:(1)阻断IL-6/STAT3信号后可以减弱骨关节炎小鼠关节软骨的破坏程度。(2)阻断IL-6/STAT3信号后可以减少骨关节炎小鼠软骨下骨骨硬化的发生。(3)阻断IL-6/STAT3信号后可以减少骨关节炎小鼠软骨下骨骨髓间充质干细胞和前成骨细胞的数量。