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目的:肝性脑病（hepatic encephalopathy,HE）在急性肝功能衰竭（acute liver failure,ALF）患者中的发病率高达80%,是ALF最常见的死亡原因。HE患者常出现脑水肿甚至发生脑疝,并以脑部星形胶质细胞（astrocyte,AS）肿胀为最突出的神经病理学特征。关于HE的发病机制,氨中毒学说一直为主流学说。ALF发生时,大量氨进入AS中,并经谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase,GS）催化为谷氨酰胺（glutamine,Gln）。一方面,富集Gln致使AS内部渗透压急剧增高,导致细胞外液流入而肿胀。另一方面,Gln被转运到线粒体中并被再次代谢为氨和谷氨酸,对线粒体造成进一步损伤。氨进入AS的主要途径为主动转运,但其转运蛋白一直未被发现。近期研究表明,Rh糖蛋白家族可能与NH3/NH4+的特异性转运相关,其中RhAG/Rhag、RhBG/Rhbg、RhCG/Rhcg可能为主要转运蛋白。RhCG/Rhcg在氨运输器官中广泛表达,包括肾脏、中枢神经系统、睾丸、肺、肝、胃和肠道。本课题组前期研究发现,ALF并发HE小鼠脑微血管内皮细胞和AS的Rhcg表达显著增加,且表达量与脑组织NH3/NH4+浓度升高呈正相关。因此,本研究推测RhCG/Rhcg可能在AS转运氨并肿胀的过程中起关键作用。同时,炎症介质TNF-α也在AS肿胀过程中起重要作用。前期研究表明,其可能促进AS转运氨。本课题组前期研究发现ALF动物血清中TNF-α水平明显升高,以抗TNF-α-Ig G抗体和TNF-α-R1抗体阻断TNF-α产生则可以降低ALF小鼠的HE的发病率及死亡率。综上所述,本研究以SVG p12星形胶质细胞为研究对象,构建了慢病毒转染RhCG基因沉默和过表达稳转细胞系,以验证RhCG蛋白是否为AS表面的主要氨转运蛋白。同时,探讨炎症因子TNF-α是否影响AS上RhCG的表达进而影响氨的转运。同时利用CRISPR/Cas9技术获得AS Rhcg基因c KO小鼠,于体内实验证实了敲除Rhcg基因能够降低脑氨浓度、改善HE症状。通过上述研究,有助于深入了解HE的发病机制,为HE靶向治疗提供新的方向。研究方法:1.建立慢病毒转染RhCG基因沉默稳转细胞株及慢病毒转染RhCG基因过表达稳转细胞株,于培养基中加入NH4Cl模拟HE的高血氨环境,并通过测定氨通透率、AS中GS活性、AS中Gln浓度、线粒体脱氢酶活性（MTS法）、电镜观察AS及其中线粒体形态,研究RhCG蛋白是否参与HE患者AS的氨转运过程。2.测定炎性因子TNF-α对AS中RhCG基因的转录、表达水平影响,并以1中方法验证高TNF-α环境是否加重AS的肿胀程度。3.利用CRISPR/Cas9技术,获得AS Rhcg基因c KO小鼠。Rhcg-/-组（敲除组）和Rhcgflox/flox（对照组）小鼠进行13N-氨micro PET显像。再应用D-Gal N/LPS制备ALF模型,检测动物血氨、脑氨、血清ALT、血清TNF-α水平。进行肝脏及脑组织HE染色。免疫组化（Immunohistochemistry,IHC）检测Gln,免疫荧光法（Immunofluorescent assays,IFA）检测GS。结果:1.RhCG基因沉默稳转细胞株的建立。1.1 shRNA 1355转染AS后RhCG蛋白表达量较空载慢病毒对照（negative control,NC）组显著减低,筛选为合成慢病毒的序列。1.2于转染后72 h观察不同转染浓度细胞的荧光强度,并选择MOI=20+P为最优条件。1.3选择0.5μg/m L为转染细胞的嘌呤霉素筛选浓度。1.4 RhCG基因沉默组RhCG mRNA转录及蛋白表达量较NC和生理盐水（normal saline,NS）对照组显著降低。RhCG mRNA转录水平较NC和NS下降均为89%,蛋白表达量分别下降69%和55%。2.RhCG基因过表达稳转细胞株的建立2.1 72 h观察各组细胞的荧光强度,MOI=20+P,100+P荧光强度最强。选择MOI=20+P为转染条件。2.2 RhCG基因过表达组RhCG mRNA转录及RhCG蛋白表达量较NC和NS对照组显著增加。3.沉默RhCG基因对高氨环境下AS肿胀的影响3.1 RhCG基因沉默组AS较NC组的氨通过率于1、5、15 min分别减少33.99%、46.29%、55.75%（P＜0.05）。3.2 RhCG基因沉默组AS较NC组的GS活性于1、5、15 min分别减少48.35%、35.85%、18.07%（P＜0.05）。3.3 RhCG基因沉默组AS较NC组的Gln浓度于1、5 min分别减少51.23%、45.61%（P＜0.05）。3.4 RhCG基因沉默组AS较NC组的线粒体MTS值于1、5、15、30 min分别升高24.56%、22.15%、22.40%、27.35%（P＜0.05）。3.5电镜观察细胞形态:3.5.1 SVG p12+NH4Cl:细胞水肿,细胞膜完整连续,线粒体多呈卵圆形,大部分肿胀,基质略变浅,嵴少量断裂、减少,少量线粒体严重肿胀,局部空泡化、嵴缺失、紊乱。提示AS肿胀,线粒体损伤,符合HE的表现。3.5.2 RhCG基因沉默组+NH4Cl:细胞膜完整连续,胞质无明显水肿,但可见较多细胞器空泡,细胞核膜清晰,核周隙未见明显增宽;线粒体大多未见明显肿胀,基质均匀,少部分局部溶解,嵴缺失,膜破损。提示AS肿胀及线粒体损伤,但与正常表达RhCG的AS相比,损伤显著减轻。4.过表达RhCG基因对高氨环境下AS肿胀的影响4.1 RhCG基因过表达组AS较NC组的氨通透率于1、5、15 min分别升高101.30%、60.06%、83.62%（P＜0.05）。4.2 RhCG基因过表达组AS较NC组的GS活性于1、5、15 min分别升高40.30%、63.49%、48.85%（P＜0.05）。4.3 RhCG基因过表达组AS较NC组的Gln浓度于1、5、15 min分别升高75.87%、83.17%、166.89%（P＜0.05）。4.4 RhCG基因过表达组AS较NC组线粒体MTS值于1、5、15、30 min分别减低14.55%、14.06%、25.75%、12.61%（P＜0.05）。4.5电镜观察细胞形态:4.5.1 SVG p12+NH4Cl:细胞水肿,细胞膜完整连续,线粒体多呈卵圆形,大部分肿胀,基质略变浅,嵴少量断裂、减少,少量线粒体严重肿胀,局部空泡化、嵴缺失、紊乱。提示AS肿胀,线粒体损伤,符合HE的表现。4.5.2 RhCG基因过表达组+NH4Cl:细胞呈卵圆形,水肿,细胞膜较完整,未见明显破损;线粒体肿胀,基质不匀,部分嵴断裂。提示AS肿胀及线粒体损伤,但与正常表达RhCG的AS相比,损伤显著加重。5.TNF-α对AS RhCG基因表达量及氨转运的影响5.1 TNF-α作用下,AS中RhCG mRNA转录及蛋白表达水平于4 h、8 h、12 h、24h较NS对照组升高。其中12 h升高具有显著性。5.2 TNF-α作用下,高氨环境下AS的氨通透率较对照组（无TNF-α）于1、5、15min分别升高263.79%、149.96%、148.88%（P＜0.05）。5.3 TNF-α作用下,高氨环境下AS的GS活性较对照组（无TNF-α）于1、5、15min分别升高59.49%、54.95%、72.70%（P＜0.05）。5.4 TNF-α作用下,高氨环境下AS的Gln浓度较对照组（无TNF-α）于5、15 min分别升高39.76%、53.21%（P＜0.05）。5.5 TNF-α作用下,高氨环境下AS的MTS值较对照组（无TNF-α）于1、5、15和30 min分别减低12.15%、11.60%、11.95%、12.80%（P＜0.05）。5.6电镜观察细胞形态:5.6.1 SVG p12:细胞膜完整连续,胞质无明显水肿;线粒体大多基质较均匀,嵴结构清晰、排列整齐。提示AS状态正常。5.6.2 SVG p12+NH4Cl:细胞水肿,细胞膜完整连续,线粒体多呈卵圆形,大部分肿胀,基质略变浅,嵴少量断裂、减少,少量线粒体严重肿胀,局部空泡化、嵴缺失、紊乱。提示AS肿胀,线粒体损伤,符合HE的表现。5.6.3 SVG p12+NH4Cl+TNF-α:细胞水肿及细胞器肿胀明显,胞内可见较多细胞器空泡,细胞膜完整连续;线粒体的数量减少,严重肿胀,体积增大,基质不匀,嵴缺失、紊乱。提示AS肿胀,线粒体损伤加重。6.星形胶质细胞Rhcg基因敲除对急性肝功能衰竭模型中小鼠脑氨中毒的影响。6.1 Rhcg-/-组（敲除组）小鼠13N-氨micro PET显像头部SUV值显著低于Rhcgflox/flox组（对照组）,（P＜0.05）。6.2用D-Gal N+LPS造ALF模型后Rhcg-/-组小鼠HE程度轻于Rhcgflox/flox组。6.3 Rhcg-/-组和Rhcgflox/flox组小鼠血清ALT、血清TNF-α、血氨水平差异无显著性。6.4 Rhcg-/-组小鼠脑氨水平显著低于Rhcgflox/flox组（P＜0.05）。6.5 Rhcg-/-组和Rhcgflox/flox组小鼠肝脏HE染色均提示肝坏死。6.6 Rhcg-/-组小鼠脑HE染色脑水肿及AS肿胀较Rhcgflox/flox组轻。6.7 Rhcg-/-组小鼠脑GS及Gln含量显著低于Rhcgflox/flox组（P＜0.05）。结论:1.星形胶质细胞SVG p12细胞系于细胞膜上转录及表达RhCG基因。2.RhCG是参与星形胶质细胞SVG p12氨主动转运的主要蛋白之一。可转运氨进入细胞,增强GS活性,生成大量Gln,引起线粒体损伤及细胞水肿。3.TNF-α可显著促进星形胶质细胞SVG p12 RhCG基因的转录、表达,同时促使氨转运进入星形胶质细胞SVG p12,加重线粒体损伤及细胞水肿。4.通过体内实验证实特异性敲除AS上RhCG后,可显著减少AS对氨的内转运,从而减少Gln在AS中的堆积,改善AS肿胀。