研究背景及目的病毒性心肌炎是心血管系统常见疾病,经积极治疗大多可痊愈,但仍有少数患者可迁延为慢性心肌炎,甚至发展为扩张型心肌病而预后不良。慢性病毒性心肌炎主要病理改变是心肌Ⅰ型、Ⅲ型胶原的增生及其比例的失调,因此阻逆胶原增生,抑制心肌纤维化是防止慢性病毒性心肌炎向扩张型心肌病转化的关键。现已证实,引起心肌胶原重构的主要因素是基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)系统的失衡及一些内分泌激素和细胞因子异常激活。基质金属蛋白酶是降解细胞外基质成分的最主要蛋白水解系统,在组织重构中起重要作用,其中MMP1主要降解心肌中含量最多的工、Ⅲ型胶原。基质金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitors of metalloproteinases, TIMPs)是MMPs的内源性特异性抑制物,TIMP1对各种MMPs均具有抑制作用,尤其是对MMP1。MMPs、TIMPs及其调节因子间的相互作用,决定了心肌间质重构过程的进展。一些内分泌激素和细胞因子又是调节MMPs系统的主要因素,其中血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)及转化生长因子-betal (transforming growth factor-betal, TGF-β1)在调节MMPs、TIMPs的平衡中发挥重要作用。TGF-β1可通过增加TIMPs的合成,抑制MMPs的合成及分泌而致胶原合成增加,降解减少；AngⅡ可通过直接刺激TIMPs的表达,抑制胶原降解,也可通过上调TGF-β1表达导致胶原增生。含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶(a distintegrin and metalloprotease with thrombospondin type 1 motifs, ADAMTS-1)来源于肿瘤细胞,因其蛋白质氨基酸序列与蛇毒金属蛋白酶和血小板反应素相似,因而命名为ADAMTS-1。近年研究发现其蛋白质分子是具有分泌功能的金属蛋白酶,可以分泌到细胞外基质(ECM)并参与ECM蛋白的调控。目前对于ADAMTS-1在间质纤维化方面的研究很少,且研究主要针对肝脏及肾脏的纤维化,在心肌间质纤维化中的研究国内外罕见报道。血清Ⅰ型前胶原羧基端肽(procollagen typeⅠcarboxyterminal propeptide, PICP)、Ⅲ型前胶原氨基端肽(procollagen typeⅢaminoterminal propeptide, PⅢNP)是心肌Ⅰ型和Ⅲ型胶原的前体多肽,是前胶原转换为胶原过程中脱离前胶原的游离肽段,其随胶原纤维合成的增加而增加,能较好反映心肌Ⅰ型和Ⅲ型胶原的合成。Ⅰ型胶原羧基末端肽(carboxyterminal telopeptide of typeⅠcollagen, ICTP)是Ⅰ型胶原降解过程中是与Ⅰ型胶原以1：1比例释放出来的,因此被认为是Ⅰ型胶原降解的标志物,但目前尚未发现能较好反映Ⅲ型胶原降解的标志物。血管紧张素转化酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitors, ACEI)通过抑制AngⅡ的生成发挥抗纤维化作用,其在抗心肌纤维化方面疗效肯定,但因其可致血压下降、刺激性咳嗽等副作用使得部分患者不能耐受。近年研究表明苦参素在抗肝脏纤维化方面疗效显著、副作用少,因此其是否同样可抑制心肌纤维化值得研究。本研究一方面通过观察慢性病毒性心肌炎胶原代谢变化,检测心肌组织及(或)血清中AngⅡ、TGF-β1、MMP1、TIMP1、ADAMTS-1、PICP、PⅢNP、ICTP等明确与胶原代谢有关的细胞因子作用,为阻逆胶原增生,抑制心肌纤维化提供理论支持；另一方面通过比较苦参素、卡托普利干预作用,为抗慢性病毒性心肌炎心肌纤维化治疗提供更多更好的选择。方法1.慢性病毒性心肌炎动物模型制备11 1只4周龄BALB／C健康雄性小鼠随机分为正常对照组1(1组)(n=8),正常对照组2(2组)(n=8),慢性病毒性心肌炎1组(3组)(n=20),慢性病毒性心肌炎2组(4组)(n=25),卡托普利干预组(5组)(n=25)及苦参素干预组(6组)(n=25)。3、4、5、6组分别于第0天、14天及28天腹腔接种CVB3109TCID50 0.2mL、0.25ml、0.3ml共三次,正常对照组小鼠同期腹腔注射等体积生理盐水。2.超声心动图检查42天时将1组、3组小鼠称重后每只小鼠腹腔注射3%水合氯醛(0.01-0.015ml／g),麻醉后应用PHILIPS 7500彩色多普勒超声显像仪,探头频率3.5 MHz行心脏超声检查；包括心率(HR)、左室舒张末期内径(LVDD).左室收缩末期内径(LVSD).主动脉血流峰值速度(Vp),并计算短轴缩短率(FS)和射血分数(EF)。检查后立即断髓处死,留取血液及心肌组织。42天后5组按卡托普利100mg／kg·d,6组按苦参素100mg／kg·d,灌胃给药,每日一次,共28天；同期给予2组及4组等体积生理盐水灌胃。70天将2、4、5、6组小鼠麻醉后行心脏超声检查,检查后断髓处死,亦留取血液及心肌组织。所有小鼠标本进行以下指标检测了解胶原代谢情况。3.计算心脏／体重比值4.常规HE染色5.苦味酸天狼猩红染色观察胶原纤维分布情况6.图像分析系统检测心肌纤维化面积,计算胶原容积分数(CVF)7.ELISA法检测血清Ⅲ型前胶原氨基端前肽(PⅢNP).I型前胶原羧基端前肽(PICP)浓度8.免疫组化法检测心肌组织AngⅡ、ADAMTS-1、TGF-β1、MMP1及TIMP1表达。9.免疫荧光法检测心肌组织ADAMTS-1表达10.Western blot法检测小鼠心肌组织中ADAMTS-1、TGF-β1、MMP1及TIMP1蛋白水平的表达11.心肌组织总RNA提取及RT-PCR检测ADAMTS-1、Ⅰ及Ⅲ型胶原、ICTPmRNA含量。12.计算Ⅰ／Ⅲ胶原比值结果1.两慢性病毒性心肌炎组小鼠的心脏／体重比值均较同期正常对照组明显增加。卡托普利干预组及苦参素干预组小鼠的心脏／体重比值均较慢性病毒性心肌炎2组小鼠明显降低,但两干预组小鼠心脏／体重比值无明显差异。2.心脏多普勒超声显示两慢性病毒性心肌炎组小鼠的LVDD及LVSD较同期正常对照组增大,Vp、FS及EF较正常组明显降低,而HR则明显增快。卡托普利干预组及苦参素干预组小鼠各项指标均比慢性病毒性心肌炎2组明显改善,但两干预组小鼠各项指标相比无显著差异。3.两正常对照组小鼠HE染色显示心肌细胞形态正常,肌原纤维排列致密、整齐,间质成纤维细胞数量、形态正常,无明显病理改变；而同期慢性病毒性心肌炎组小鼠心肌纤维排列疏松,间质成纤维细胞明显增生。卡托普利干预组及苦参素干预组小鼠心肌组织病理变化均比慢性病毒性心肌炎2组明显改善,但两干预组相比无明显差异。4.两正常对照组小鼠苦味酸天狼猩红染色心肌细胞间隙仅可见少量红色纤细的胶原；而同期慢性病毒性心肌炎组心肌胶原明显增生、变粗,并且将心肌细胞分割呈网筛状。两慢性病毒性心肌炎组CVF同期正常对照组小鼠明显升高。而卡托普利干预组及苦参素干预组小鼠心肌CVF均较慢性病毒性心肌炎2组显著降低,但两干预组之间却无明显差异。5.两慢性病毒性心肌炎组小鼠心肌组织Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原的含量均较同期正常组明显增加,但Ⅰ型胶原增加更为突出,Ⅰ／Ⅲ型胶原比例也较正常对照组明显增大。而卡托普利干预组及苦参素干预组小鼠心肌Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的含量及Ⅰ／Ⅲ型胶原比例均较慢性病毒性心肌炎2组显著降低。但两干预组相比无统计学意义。6.两慢性病毒性心肌炎组小鼠血清PICP、PⅢNP明显高于同期正常对照组,且慢性病毒性心肌炎2组小鼠心肌ICTP较正常组2显著降低。而卡托普利干预组及苦参素干预组小鼠血清PICP、PⅢNP浓度较慢性病毒性心肌炎2组显著降低,而心肌ICTP却较慢性病毒性心肌炎2组明显升高。但两干预组相比均无明显差异。7.两慢性病毒性心肌炎小鼠心肌组织中AngⅡ及TGF-β1表达较正常小鼠均明显增多,且二者均与小鼠心肌CVF呈正相关。卡托普利干预组小鼠AngⅡ及TGF-β1表达均较慢性病毒性心肌炎小鼠明显降低,但苦参素干预组小鼠心肌组织AngⅡ的表达较慢性病毒性心肌炎小鼠无明显改变,仅TGF-β1表达均较慢性病毒性心肌炎小鼠明显降低,两干预组TGF-β1表达差异不显著。8.两慢性病毒性心肌炎小鼠心肌组织中MMP-1表达较正常小鼠均明显减少,与小鼠心肌CVF呈负相关；TIMP-1较正常小鼠均明显增多,与小鼠心肌CVF呈正相关。卡托普利干预组及苦参素干预组小鼠心肌MMP-1表达均较慢性病毒性心肌炎2组显著增加,而TIMP-1明显减少,但两干预组MMP-1及TIMP-1表达无明显差异。MMP-1表达与小鼠心肌ICTP呈正相关。9.两慢性病毒性心肌炎小鼠心肌组织ADAMTS-1表达较正常小鼠均明显减少,与小鼠心肌CVF呈负相关,与小鼠心肌ICTP呈正相关。卡托普利干预组及苦参素干预组小鼠心肌ADAMTS-1表达均较慢性病毒性心肌炎2组显著增加,但两干预组差异不明显。10.慢性病毒性心肌炎组小鼠心肌组织AngⅡ与TGF-β1、TIMP-1呈正相关(r=0.73,P＜O.01；r=0.63,P<0.05),而与MMP-1及ADAMTS-1呈负相关(r=-0.63,P＜0.05；r=-0.59,P<0.05)；TGF-β1与TIMP-1呈正相关(r=0.61,P＜0.05),而与MMP-1及ADAMTS-1负相关(r=-0.66,P＜0.05；r=-0.61,P＜0.05);MMP-1与Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原呈负相关(r=-0.65,P＜0.05;r=-0.63,P＜0.05),TIMP-1与Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原呈正相(r=0.64,P<0.05;r=0.62,P<0.05),ADAMTS-1与Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原呈负相关(r=-0.6,P＜0.05；r=-0.58,P＜0.05),但ADAMTS-1与MMP-1及TIMP-1无关(r均=0,P>0.05)。结论：1.慢性病毒性心肌炎的病理特征即为心肌间质纤维化,且主要表现为Ⅰ、Ⅲ型胶原的增生及其比例的失调。2.AngⅡ、TGF-β1在促进心肌纤维化方面相互关联且作用一致,二者可通过上调TIMP-1的表达、下调MMP-1及ADAMTS-1的表达促进纤维化的发生、发展。3.MMP-1可通过降解心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原发挥抗心肌纤维化的作用。4. ADAMTS-1同MMP-1一样,通过降解Ⅰ、Ⅲ型胶原发挥抗心肌纤维化的作用,但其独立于MMP-1／TIMP-1途径。5.卡托普利通过抑制AngⅡ的表达,进而下调TGF-β1的表达、促进MMP-1及ADAMTS-1的表达发挥抗心肌纤维化的作用。6.苦参素具有明确的抗心肌纤维化作用,且作用与卡托普利相当。7.苦参素并非通过下调AngⅡ的表达,而是直接下调TGF-β1的表达,进而通过促进MMP-1及ADAMTS-1的表达发挥抗心肌纤维化的作用。8.真正调控ADAMTS-1表达的是TGF-β1,AngⅡ只是作为TGF-β1的上游间接调控ADAMTS-1的表达。创新和意义：1.本研究首次证实ADAMTS-1是独立于MMP-1/TIMP-1通过降解Ⅰ、Ⅲ型胶原发挥抗心肌纤维化作用的另一途径。直接调控ADAMTS-1表达的是TGF-β1,AngⅡ只是作为TGF-β1的上游起间接调控作用。2.本研究首次在体证实苦参素具有明确的抗CVMC心肌纤维化作用,其作用机制是直接下调TGF-β1的表达,进而通过促进MMP-1及ADAMTS-1的表达发挥抗心肌纤维化的作用。3.本研究结果提示苦参素在治疗临床心肌纤维化方面或许具有广阔的前景,从而为临床心肌纤维化的治疗提供一种新的思路及实验基础,为ACEI不能耐受者提供更多可替代的选择。