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气孔是植物与外界环境进行气体交换的门户.全球植物每年约耗掉65﹪的淡水资源,而这些水分大部分是通过气孔的蒸腾作用丧失掉的.因此有必要对气孔的开关进行调控.气孔运动的分子调控离不开高效的基因开关系统,保卫细胞特异性表达的启动子近几年倍受关注.我们的设想是:当水分供应充足时,气孔尽最大限度开放,吸收CO<,2>,增加光合产量;当干旱来临时,气孔迅速关闭,减少水分丧失,提高作物的水分高效利用率.这一目标的实现,需要诱导型的保卫细胞特异性表达或强表达启动子的创建,使目的基因在特定的条件下特定的部位表达.鉴于此,该文成功地构建了两个启动子,即DGP1和SIGP1.受干旱诱导的保卫细胞特异性表达启动子(DGP1,drought induced guard cell specific promoter)的构建:利用PCR的方法,扩增出干旱应答元件和保卫细胞特异性元件,然后组装而成.转基因烟草的组织化学定位表明,DGP1驱动的gus基因在受到干旱诱导的情况下,在保卫细胞中特异性表达,而在未经干旱处理植株的保卫细胞和干旱处理的根、茎和花中均不表达;对转基因烟草GUS活性的定量分析表明,GUS活性明显地受干旱诱导,并且随着处理时间的延长而增强,其中干旱诱导8hr后GUS的活性是诱导前的179倍.而根、茎和叶肉组织在干旱诱导后GUS活性虽然有所提高,但变化不大.这些结果证明,在植物遭遇干旱胁迫时,DGP1启动子可以驱动目的基因在保卫细胞中特异性表达.构建了一个受多种胁迫诱导的保卫细胞强表达启动子(SIGP1,stress induced guard cell promoter).该启动子全长746bp,包括多个TCGT基序、三个5-TAAAG-3核心序列和一个TATA框.通过对T1代转基因苗的组织化学定位表明,该启动子驱动的gus基因在逆境(如干旱、ABA、高盐和冷)胁迫的叶片中表达,根中不表达,且老叶中的表达量高于幼叶中的表达量,说明其表达受发育阶段的调控.对下表皮的GUS染色发现,胁迫处理前保卫细胞的染色较浅,而处理后染色明显加深,说明SIGP1启动子可以驱动目的基因在处理后的保卫细胞中强表达.GUS活性荧光定量分析表明,SIGP1启动子驱动的GUS活性在干旱、ABA、高盐和冷等逆境处理下,在根的表达很微弱,且随着处理时间的延长变化不大,但在叶片和表皮中的GUS活性都有增加的趋势.为了深入理解调控气孔运动的分子机制,除了对保卫细胞特异性表达启动子进行研究外,还对与气孔运动相关的转录因子进行了研究.我们利用RT-PCR的方法,从拟南芥中克隆了与在气孔中表达较多的StDOF1基因的同源基因Atdof1.7,构建了该基因的超表达载体,获得了T1代转基因烟草苗.通过对气孔运动的观察发现,该基因的超表达使叶片表面气孔密度降低,并且促进了气孔的开关.为我们将来从调控转录因子的表达入手,人工干预气孔的开关运动提供理论上的依据.