【摘 要】
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背景游离皮瓣缺血再灌注损伤是导致移植皮瓣部分或全部坏死的主要原因之一。这是一个复杂的病理病生过程,部分学者认为自由基的作用、细胞内钙超载和白细胞的激活造成的细胞坏死和凋亡是缺血再灌注损伤发生的重要原因,但近年来,研究发现细胞焦亡在其中可能起着重要作用。目的本研究旨在验证缺血再灌注是否通过Caspase-4/Gasdermin-D非经典信号通路细胞焦亡导致游离皮瓣发生损伤的机制,及VX-765和NS
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背景游离皮瓣缺血再灌注损伤是导致移植皮瓣部分或全部坏死的主要原因之一。这是一个复杂的病理病生过程,部分学者认为自由基的作用、细胞内钙超载和白细胞的激活造成的细胞坏死和凋亡是缺血再灌注损伤发生的重要原因,但近年来,研究发现细胞焦亡在其中可能起着重要作用。目的本研究旨在验证缺血再灌注是否通过Caspase-4/Gasdermin-D非经典信号通路细胞焦亡导致游离皮瓣发生损伤的机制,及VX-765和NSA能否通过抑制Caspase-4/Gasdermin-D非经典信号通路细胞焦亡从而增强缺血游离皮瓣成活能力的作用。方法（1）本实验体外以HUVECs作为研究对象,建立体外HUVECs I 3h/R 24h最佳极度缺血模型,进行蛋白质组学及生信分析筛选差异表达蛋白并行透射电镜验证HUVECs在缺血再灌注时是否发生细胞焦亡。（2）建立体外HUVECs I 2h/R 24h和I 3h/R 24h模型,采用细胞划痕及CCK-8实验分析HUVECs缺血再灌注处理后（加入canspase-4抑制剂VX-765和GSDMD抑制剂NSA）细胞表型变化,并采用RTq PCR、Western Blot及免疫荧光实验方法分析抑制caspase-4和Gasdermin-D的表达后TRAF-6、BCL-XL、p-BCL-XL、Caspase-1、Caspase-3、Caspase-4及GSDMD及N-Gasdermin-D等蛋白表达的影响。（3）本实验以雄性SD大鼠为研究对象,通过构建大鼠腹部浅动静脉闭塞再灌注模型从而模拟大鼠腹部游离皮瓣状态,行透射电镜实验验证腹部游离皮瓣在缺血时是否发生细胞焦亡。通过模拟大鼠腹部游离皮瓣I 5h/R 7d状态,抑制Caspase-4和Gasdermin-D的表达,7天后观察皮瓣活面积,另外,采用CD31行免疫组化染色观察腹部皮瓣新生小血管情况。建立大鼠腹部游离皮瓣I 5h/R 0.5h模型,行Western Blot实验方法分析抑制caspase-4和Gasdermin-D的表达后TRAF-6、BCL-XL、p-BCL-XL、Caspase-1、Caspase-3、Caspase-4及GSDMD及N-Gasdermin-D等蛋白表达的影响。结果（1）成功建立了体外HUVECs I 2h/R 24h模型,发现HUVECs在缺血再灌注时发生细胞焦亡。（2）建立了体外HUVECs I 2h/R 24h和I 3h/R 24h模型,TRAF6、Caspase-4及Gasdermin-D及N-Gasdermin-D表达升高,且抑制Caspase-4及Gasdermin-D表达后HUVECs活力及迁移能力明显升高。（3）成功建立SD大鼠腹部游离皮瓣I 3h模型,发现游离皮瓣在缺血再灌注时血管内皮细胞发生焦亡。建立SD大鼠腹部游离皮瓣I5h/R 7d模型,且抑制Caspase-4及GSDMD表达后皮瓣成活面积和新生小血管明显增多。建立大鼠腹部游离皮瓣I 5h/R 0.5h模型,Caspase-4及Gasdermin-D及N-Gasdermin-D表达升高。结论（1）在HUVECs缺血再灌注损伤模型中,缺血再灌注通过Caspase-4/Gasdermin-D非经典信号通路致HUVECs发生焦亡,利用VX-765和NSA抑制Caspase-4/Gasdermin-D非经典信号通路时,HUVEC活力及迁移能力明显增强。（2）在SD大鼠腹部游离皮瓣I 5h/R 7d模型中,缺血再灌注通过Caspase-4/Gasdermin-D非经典信号通路致游离皮瓣发生焦亡,利用VX-765和NSA抑制Caspase-4/Gasdermin-D非经典信号通路时,大鼠腹部游离皮瓣成活面积明显增多。
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