论文部分内容阅读
目前,糖尿病(Diabetes Mellitus)已成为全世界许多国家的常见病和多发病,其死亡率已居肿瘤、心血管之后的第三位。我国糖尿病患者数量居全球首位,而其中约95%为2型糖尿病患者。因此糖尿病的治疗任务刻不容缓。胰岛β细胞功能障碍和外周组织的胰岛素抵抗(Insulin Resistance, IR)是2型糖尿病发病的两个关键因素。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal Kinase, JNK)是有丝分裂原活化蛋白激酶[Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK)]超家族的重要一员,该家族还包括ERK和p38。JNK信号通路是参与糖尿病发病机制的重要通路。糖尿病状态下胰岛β细胞中,氧化应激能导致JNK激活,损害核内胰岛素信号通路,从而使胰岛素基因表达水平的降低,破坏胰岛素合成。此外,JNK的激活可使胰岛素受体底物IRS-1ser307位点磷酸化,导致胰岛素抵抗。桑叶及其有效成分已被报道具有良好的降低血糖作用,但其降血糖作用分子机制鲜见报道。JNK信号通路是涉及糖尿病发病的重要通路,桑叶对糖尿病的治疗作用,是否涉及到对此通路的调控作用?本文正是基于对此问题的思考而进行探索性实验研究。1.文献研究对与2型糖尿病相关的发病机制、中医药治疗2型糖尿病的现状进行了较全面的文献综述,为本研究的立题目的提供依据。主要从以下方面展开文献研究：1.糖尿病目前的流行情况、发病机制研究进展；2.中药及其有效成分治疗2型糖尿病的现状；3.桑叶有效成分及其降血糖作用、机制研究进展；4.JNK信号通路与2型糖尿病发病机制的重要关系研究进展；5. microRNA与2型糖尿病的研究进展。2.实验研究2.1桑叶有效部位对2型糖尿病大鼠糖脂代谢的影响研究目的：建立2型糖尿病动物模型,研究桑叶总黄酮、桑叶总多糖、桑叶水提液分别对2型糖尿病大鼠血糖、血脂的影响。研究方法：SD大鼠随机分为正常对照组(NC组8只),糖尿病组,糖尿病组大鼠利用高脂高糖饲料喂养8周联合一次性腹腔注射STZ30mg·kg-1建立2型糖尿病大鼠模型,造模成功的大鼠随机分为模型对照组(DM组),桑叶总黄酮治疗组(MTF组,30mg·kg-’),桑叶总多糖治疗组(MTP组,100mg·kg-1),桑叶水提物治疗组(MWE组,6g·kg-1)和罗格列酮治疗组(RSG组,4mg·kg-1),每组10只。灌胃给药,每周称量大鼠体重、空腹血糖FBG,观察大鼠生存状态。连续给药6周后,麻醉大鼠腹主动脉取全血,测定大鼠血清游离脂肪酸NEFA、胆固醇CHO、甘油三脂TC含量。研究结果：①复制的2型糖尿病大鼠模型,与正常对照组大鼠相比较,表现出多饮多食、排泄增加、高血糖、高血脂症状,且后期体重减轻,符合2型糖尿病临床特点。②经过治疗6周,NC组大鼠体重呈直线上升；DM组大鼠体重显著下降,与NC组比较差异具显著性(P<0.01)；与DM组相比,MWE、MTP、MTF体重更重,差异具有显著性(P<0.01或0.05)。③MTF、MTP治疗第4周,MWE治疗第5周大鼠FBG开始下降,与未给药时相比具有显著差异(P<0.05)。④给药6周后,与NC组比较,DM组NEFA、TG、CHO均存在显著性差异(P＜0.05)。与DM组比较,MWE组TG、CHO降低(P<0.05), NEFA无显著差异(P>0.05)；MTF组TG、CHO、MDA均降低(P<0.05),NEFA无显著差异(P>0.05)；MTP组TG(P<0.05),NEFA、CHO无显著差异(P>0.05)；RSG组NEFA、TG、CHO无显著差异(P>0.05)。研究结论：建立的2型糖尿病模型符合实验要求；桑叶有效部位具有改善糖尿病大鼠生存状态、降低空腹血糖、且在降低血糖的同时降低血脂的作用,而罗格列酮具有良好的降血糖作用,无降血脂作用。桑叶各个不同有效部位在降血糖、改善血脂方面的作用表现不一。2.2桑叶有效部位对2型糖尿病大鼠胰岛组织的作用及功能的影响研究目的：评价桑叶有效部位对2型糖尿病大鼠胰岛组织的作用及胰岛细胞的功能影响。研究方法：采用先饲以高脂肪饲料联合一次性腹腔注射小剂量STZ,破坏部分胰岛β细胞的造模方法建立2型糖尿病大鼠模型,接着采用桑叶总黄酮MTF、桑叶总多糖MTP、桑叶水提液MWE治疗6周,干预过程、干预方法与实验2.1中相同。于第6周各组大鼠行灌胃葡萄糖耐量OGTT试验；随后麻醉大鼠腹主动脉取全血,Elisa法测定大鼠胰岛素INS含量；测定大鼠血清MDA、SOD含量；取胰岛组织,分别再行HE染色、透射电镜观察胰岛组织病理学形态变化。研究结果：①胰岛HE染色显示：模型组大鼠胰岛内β细胞所剩无几,几乎成空泡状,胰岛细胞萎缩,细胞核呈密集现象,胰腺损伤严重。MTF、MTP、MWE、RSG给药组胰岛细胞较模型组明显改善。②透射电镜结果显示正常对照组大鼠β细胞位于胰岛中央,胞质内有大量的、大小不一的分泌颗粒,颗粒内有大小、形状不同的致密核芯。颗粒的电子密度高低不等,颗粒外包以界膜,核芯与界膜之间有较宽的清亮间隙。胞质内有散在的线粒体,呈圆形或细长形。其余组β细胞胞核固缩,甚至不明显,核膜凹陷,分泌颗粒数量减少,空晕增宽,甚至界膜破裂,呈现不同程度的细胞损伤；③MWE组、MTF组、MTP组及RSG组在OGTT2h时,血糖水平均低于模型组,且差异具有统计学意义(P<0.05)。④给药6周后,与NC组比较,DM组INS、MDA、SOD均存在显著性差异(P<0.05)。与DM组比较,MWE组INS、SOD升高(P<0.05),MDA无显著差异(P>0.05)；MTF组INS、SOD升高,MDA降低(P＜0.05)；MTP组INS、SOD升高,MDA降低(P<0.05)；RSG组INS、SOD升高,MDA降低(P<0.05)。研究结论：桑叶的各个有效部位均可增加糖尿病大鼠胰岛素分泌,对大鼠胰岛功能具有一定的修复作用。桑叶总黄酮、桑叶总多糖、桑叶水提液这三个部位之间作用没有显著差异,但从OGTT、血清胰岛素含量以及病理检查等数据看,桑叶总黄酮对2型糖尿病大鼠胰岛功能的影响更为明显。2.3桑叶有效部位对2型糖尿病大鼠JNK信号通路JNK、AKT、PDX-1、IRS-1mRNA表达的影响研究目的：探索桑叶有效部位降血糖、保护胰岛功能的作用机制及其与JNK信号通路的关系,测定桑叶有效部位对2型糖尿病大鼠JNK信号通路JNK、AKT、PDX-1、 IRS-1mRNA表达的影响。研究方法：采用上述方法建立2型糖尿病模型并进行干预治疗后,取大鼠胰岛组织,提取RNA并进行纯度测定。Q-PCR测定大鼠胰岛组织JNK、AKT、PDX-1、IRS-1mRNA的表达水平。研究结果：①与正常对照组相比较,模型组大鼠胰岛JNKmRNA的表达水平显著增加(P＜0.01),AKT、PDX-1、IRS-1mRNA的表达水平显著降低(P<0.01)；②与模型组比较：桑叶总多糖下调了JNKmRNA的表达(P<0.05),上调AKT、IRS-1mRNA的表达水平(P<0.01),对PDX-1mRNA的表达无显著影响；桑叶总黄酮能显著上调AKT、 PDX-1mRNA的表达(P<0.05),对IRS-1mRNA、JNKmRNA有一定的影响,但差异无显著性；桑叶水提液显著上调AKT、PDX-1、IRS-1mRNA的表达(P<0.01),对JNKmRNA表达的影响无显著差异；③罗格列酮可以显著下调JNKmRNA的表达(P<0.05),上调AKT、PDX-1、IRS-1mRNA的表达(P＜0.01)。研究结论：桑叶总黄酮、总多糖、水提液分别对JNK信号通路JNK、AKT、PDX-1、 IRS-1靶点具有不同程度的影响,它们产生降血糖作用以及保护胰岛组织、修复胰岛功能的分子机制涉及到了JNK信号通路。2.4桑叶有效部位对2型糖尿病大鼠JNK信号通路JNK、AKT、PDX-1、IRS-1蛋白表达及磷酸化的影响研究目的：探索桑叶有效部位降血糖、保护胰岛功能的作用机制及其与JNK信号通路的关系,测定桑叶有效部位对2型糖尿病大鼠JNK信号通路JNK、AKT、PDX-1、IRS-1蛋白表达及磷酸化水平的影响。研究方法：采用上述方法建立2型糖尿病模型并进行干预治疗后,取大鼠胰岛组织,切取一部分于10%的PBS缓冲液甲醛固定后,切片,免疫组化检测JNK、p-JNK的表达；另一部分提取总蛋白,Western blot法检测JNK, p-JNK(Thrl83/Tyrl85), AKT, ph-AKT ser473, IRS-1, p-IRS-lser307, PDX-1在胰岛组织中的表达。研究结果：免疫组化结果显示JNK、p-JNK在各组胰腺中具有不同程度的表达。Western blot结果显示：与正常对照组相比较,模型组JNK、IRS-1ser30蛋白磷酸化程度显著增加(P<0.01),Aktser473磷酸化减弱(P<0.01),PDX-1蛋白表达减弱(P<0.01)。与模型组相比较：①桑叶总多糖、桑叶总黄酮、桑叶水提液显著降低JNK(Thr183/Tyr185)、IRS-1ser30磷酸化水平(P＜0.01),提高PDX-1蛋白的表达(P<0.01),对Aktser473磷酸化水平无显著影响；②罗格列酮可以显著降低JNK(Thr183/Tyrl85)、IRS-1ser307磷酸化水平(P＜0.01),提高PDX-1蛋白的表达(P<0.01),提高Aktser473磷酸化水平(P＜0.05)。研究结论：桑叶总多糖、桑叶总黄酮、桑叶水提液均可降低JNK磷酸化水平,抑制JNK信号对大鼠胰岛组织的损伤。桑叶的降血糖、保护胰岛功能的作用涉及到了JNK信号通路。