目的与背景:肺癌在我国是发病率最高,也是致死率最高的恶性肿瘤,其中骨转移是肺癌晚期患者的严重并发症之一,可导致严重的病理性骨折,恶性疼痛,高钙血症和脊髓压迫等骨相关事件,严重影响生活质量及生存时间。超过86%的肺癌骨转移表现为溶骨性骨破坏,主要机制是肺癌转移到骨后,在多种肿瘤因子、骨基质生长因子、微环境因素（如低氧等）等因素作用下破坏了成骨细胞介导的成骨与破骨细胞介导的溶骨组成的骨重塑平衡,最终引起溶骨性骨破坏,但其具体机制尚未完全阐明。由于破骨细胞是目前已知唯一细胞参与骨吸收的细胞,因此其在溶骨性骨破坏中的作用与机制已被广泛研究阐明。目前临床上已批准使用的抗溶骨药物如双磷酸盐、德尼单抗等,均以抑制破骨细胞分化及其介导的骨吸收为治疗靶点。但现有治疗方案的临床疗效仍有较多局限性,亟需进一步阐明肿瘤骨转移溶骨性骨破坏的分子机制为肿瘤骨转移的防治提供新的靶点。近期研究证实:成骨细胞在肿瘤骨转移的发展中也起着独特和重要的作用,成骨细胞是肿瘤骨转移后的首个应答细胞,通过释放大量的破骨及肿瘤调控因子如:RANKL/OPG,M-CSF,Semaphorin 3A（Sema3A）,VEGF-A等在调控破骨细胞迁移、分化,促进肿瘤进展等进程中发挥关键作用。既往多个研究中证实成骨细胞的成骨能力在肿瘤骨转移中可被显著抑制,课题组前期研究亦证实肺癌细胞可抑制成骨细胞介导的成骨分化,但机制并不明确,阐明其机制可为肺癌骨转移溶骨性骨破坏的防治提供新的突破。低氧是骨微环境的重要特征,而在肿瘤骨转移后因肿瘤快速增殖导致需氧量增加及微血管破坏等可导致更严重的缺氧状态。既往研究证实肿瘤相关性缺氧介导的低氧诱导因子（Hypoxia-inducible factors,HIFs）在多种肿瘤骨转移中高表达,并通过抑制成骨细胞分化,促进破骨细胞生成来促进溶骨性骨转移的进展,敲除癌细胞中HIFs可显著减少溶骨性骨破坏程度并增加骨量,但其具体机制仍待阐明。Sema4D是近期发现的新型骨代谢调控分子,在正常骨重塑中由成熟破骨细胞分泌表达并介导成骨抑制,其发现为正常骨重塑环节中骨吸收期内成熟破骨细胞可反馈抑制成骨细胞的功能以保证溶骨步骤完成提供了依据。随后的研究表明Sema4D在骨质疏松、多发性硬化、髋臼发育不良等多种骨破坏疾病中发挥重要作用。此外,Sema4D在肿瘤进展、免疫调节、血管生成、调控骨代谢等多种生理和病理过程中亦发挥重要的作用。在口腔鳞状细胞癌、卵巢上皮癌等实体肿瘤中,低氧通过HIFs调控Sema4D表达,并调控内皮细胞迁移和肿瘤血管分布,促进肿瘤生长。因此我们猜想:在肺癌骨转移中,低氧可能通过HIFs调控肺癌细胞中的Sema4D表达与分泌,介导成骨抑制而参与肺癌骨转移介导的溶骨性骨破坏。本研究拟通过一系列实验手段阐明肺癌骨转移微环境下HIFs对肺癌细胞Sema4D表达与分泌的调控作用以及其在肺癌骨转移溶骨性骨破坏中的潜在作用与机制,以期为肺癌溶骨性骨破坏的防治提供新的靶点与思路。方法:1.通过q-PCR及WB检测Sema4D在肺癌细胞株中的表达情况,通过收集肺癌细胞条件培养基,以ELISA检测Sema4D在肺癌细胞条件培养基中的分泌情况;建立肺癌细胞条件培养基与成骨细胞共培养的方法,以碱性磷酸酶染色及茜素红染色,成骨分化基因（ALPL、Oxterix、Collα1）表达检测等方式检测成骨分化水平,分析Sema4D在肺癌细胞中的表达与其成骨抑制能力的相关性;以Sema4D shRNA转染干扰肺癌细胞中Sema4D的表达与分泌;收集Sema4D干扰前后的肺癌细胞条件培养基与成骨细胞共培养,并以碱性磷酸酶染色及茜素红染色,检测成骨分化基因（ALPL、Oxterix、Collα1）表达等方式测定成骨分化水平,确定沉默Sema4D表达对肺癌细胞条件培养基成骨分化抑制能力的影响;2.以CoCl₂（100μM）预处理肺癌细胞建立低氧模型,收集常氧及低氧条件下的肺癌条件培养基与成骨前体细胞共培养,以碱性磷酸酶染色及茜素红染色,检测成骨分化基因（ALPL、Oxterix、Collα1）表达测定成骨分化水平,确定CoCl₂（100μM）模拟的低氧诱导的肺癌细胞外分泌因子对成骨细胞分化的影响;3.以q-PCR、WB及ELISA检测以1%O₂及CoCl₂（100μM）预处理诱导的低氧对肺癌细胞中Sema4D的表达与分泌的影响;4.以q-PCR、WB及ELISA检测Sema4D shRNA转染对肺癌细胞中Sema4D表达与分泌的影响,检测Sema4D shRNA转染对CoCl₂（100μM）预处理的肺癌细胞的条件培养基抑制成骨细胞分化能力（碱性磷酸酶染色及茜素红染色,检测成骨分化基因（ALPL、Oxterix、Collα1）表达）的影响,确定低氧诱导Sema4D表达与分泌在低氧下肺癌细胞显著抑制成骨细胞分化过程中的作用;5.以WB及细胞免疫荧光检测HIF-1α及HIF-2α在1%O₂及CoCl₂（100μM）预处理诱导的低氧下的表达趋势;使用靶向HIF-1α或HIF-2α的shRNA稳定转染肺癌细胞,观察干扰HIF-1α或HIF-2α对Sema4D表达与分泌的影响,确定Sema4D的上游调控机制;使用双荧光素酶实验方法确定HIF-1α对Sema4D是否存在直接调控作用,以及其在Sema4D启动子区域的可能结合位点;检测沉默肺癌细胞中HIF-1α或HIF-2α表达对低氧下肺癌细胞条件培养基抑制成骨细胞分化能力（碱性磷酸酶染色及茜素红染色,检测成骨分化基因（ALPL、Oxterix、Collα1）表达）的影响;6.以WB及q-PCR检测Sema4D的剪切酶ADAM17在1%O₂及CoCl₂（100μM）预处理诱导的低氧下的表达趋势;为确定ADAM17的上游调控机制,观察干扰HIF-1α或HIF-2α表达对肺癌细胞ADAM17表达的影响;以shRNA干扰技术或者添加ADAM17特异性抑制剂TAPI-1抑制肺癌细胞ADAM17的表达或功能后,以ELISA检测以CoCl₂（100μM）诱导的低氧下的肺癌细胞条件培养基中Sema4D的分泌水平,以明确ADAM17对Sema4D分泌的作用;检测沉默肺癌细胞中ADAM17表达对低氧下肺癌细胞条件培养基抑制成骨细胞分化能力（碱性磷酸酶染色及茜素红染色,检测成骨分化基因（ALPL、Oxterix、Collα1）表达）的影响;7.免疫组化检测HIF-1α,HIF-2α,Sema4D和ADAM17在49例肺癌骨转移灶中的表达,并分析其表达定位以及与包括性别,年龄,侵袭椎体数量,病理肿瘤类型,肿瘤分化程度和骨破坏类型等患者临床特征的相关性;分析Sema4D和ADAM17与HIF-1α,HIF-2α在肺癌骨转移灶中的表达相关性,以确定HIF-1α,HIF-2α,Sema4D和ADAM17在肺癌骨转移中的表达及临床意义。结果:1.Sema4D在多种肺癌细胞株中表达与分泌,并且Sema4D高表达肺癌细胞的条件培养基的成骨抑制能力明显强于Sema4D低表达肺癌细胞株;通过shRNA沉默肺癌细胞Sema4D的表达与分泌可显著抑制肺癌细胞条件培养基对成骨细胞分化的抑制能力;2.CoCl₂（100μM）预处理诱导的低氧显著促进了肺癌细胞条件培养基对成骨细胞分化的抑制作用;3.低氧促进肺癌细胞中Sema4D的mRNA及蛋白表达及其在肺癌条件培养基中的分泌;沉默肺癌细胞Sema4D表达减弱CoCl₂（100μM）预处理诱导的低氧下肺癌细胞条件培养基对成骨细胞分化的抑制作用;4.低氧通过HIF-1α而非HIF-2α依赖性的方式促进肺癌细胞中Sema4D的表达和分泌,双荧光素酶实验证实HIF-1α直接结合Sema4D启动子区域的1171-798碱基对并调控其转录;沉默HIF-1α而非HIF-2α可显著减弱CoCl₂处理的肺癌细胞条件培养基对成骨细胞分化的抑制作用;5.低氧通过HIF-1α而非HIF-2α依赖性的方式促进Sema4D剪切酶ADAM17在肺癌细胞中的表达,抑制ADAM17的表达或功能显著抑制Sema4D在CoCl₂处理的肺癌细胞条件培养基中的分泌;沉默肺癌细胞中ADAM17表达减弱CoCl₂（100μM）预处理诱导的低氧下肺癌细胞条件培养基对成骨细胞分化的抑制作用;6.免疫组化结果显示HIF-1α,Sema4D及ADAM17在人肺癌溶骨性骨转移灶中高表达,并且与肿瘤低分化及溶骨性骨破坏存在显著相关性;Sema4D、ADAM17在肺癌骨转移灶中的表达与HIF-1α表达存在相关性,而未发现与HIF-2α表达存在相关性。结论:在肺癌骨转移中,Sema4D在肺癌细胞株中高表达并介导肺癌细胞对成骨细胞分化的抑制。低氧通过HIF-1α而非HIF-2α直接促进肺癌细胞Sema4D的表达,并通过调控ADAM17表达调控Sema4D的胞外域剪切分泌进入条件培养基,并介导低氧下肺癌对成骨细胞成骨分化的抑制促进肺癌溶骨性骨破坏。在肺癌骨转移标本中Sema4D,ADAM17与HIF-1α在溶骨性骨破坏中高表达及存在显著相关性,揭示了肺癌骨转移溶骨性骨破坏的潜在机制,为相关肿瘤骨转移的防治提供了新的靶点。