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多囊卵巢综合征(PCOS)是一种育龄妇女常见的内分泌紊乱综合征,临床表现高度异质性,是由多基因遗传参与和环境因素共同作用的结果,其发病机制和病因还不明确。近年来,对PCOS发病机制的研究中心逐渐转移到分子生物学层面,发现包括抗苗勒氏管激素(AMH)、胰岛素样生长因子、肿瘤坏死因子、脂联素、瘦素和内脂素等许多细胞因子在内,都参与了 PCOS的发病过程,尤其AMH,除了参与性别分化,同时参与了卵子的发育、成熟、排卵、受精等过程。研究表明,血清中AMH不仅可以预测卵巢储备功能(能力),还是体外受精-胚胎移植结局的独立预测因子,AMH同时还是卵巢颗粒细胞肿瘤的重要标志物,作为诊断多囊卵巢综合征的有利工具。本试验通过构建大鼠PCOS模型,探讨大鼠卵巢囊肿形成过程中,大鼠性腺等器官增重、性激素水平以及卵巢组织AMH及其受体mRNA变化关系,以增加对PCOS发病机制的了解。一、大鼠AMHR2基因可变剪接体鉴定及分析利用RT-PCR和基因克隆测序技术在大鼠卵巢组织中检测到一种新的AMHR2 剪接体,命名为AMHR2 variant 1(AMHR2-SV1)。DNAMAN 序列比对发现,AMHR2-SV1缺失137个碱基(第十外显子)。利用NCBI ORFFinder和 ExPASy-ProtParam,预测AMHR2-SV1编码429个氨基酸残基,其编码的蛋白质分子量为45.9907 kDa。Conserved domains在线软件分析表明:AMHR2-SV1蛋白序列比完整AMHR2蛋白序列缺少128个氨基酸,丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域不完整。组织表达谱分析,在大鼠心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、子宫和卵巢中均检测到AMHR2和AMHR2-SV1两个转录本,AMHR2基因的参考转录本在大鼠的卵巢中高表达,在肝、脾和肺中表达较低,而AMHR2-SV1在卵巢中表达量最高,脾脏中表达量最低。因此推测,AMHR2表达受可变剪切机制的调控。AMHR2是AMH信号转导的专一受体,在AMH信号转导过程中发挥重要作用,而丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域是将信号由细胞表面转导至胞内的重要结构域,提示AMHR2-SV1可能对AMH信号转导发挥生物效应。二、大鼠PCOS模型构建及相关指标检测采用颈部皮下注射脱氢表雄酮(DHEA)构建大鼠PCOS模型,探索大鼠卵巢囊肿形成过程中,大鼠性腺等器官、性激素水平的变化规律。选取性未成熟的雌性SD大鼠80只(21 d),随机分为两组:试验组和对照组各40只。试验组大鼠颈部皮下注射0.2 mL/d芝麻油(每100 g体重注射6 mg DHEA);对照组注射等量注射用油,预饲期2 d,正式期20 d。分别在试验开始第5、10、15和20天称取大鼠的体重、卵巢、子宫、肝脏、肾脏和脾脏的重量计算脏器指数,采集血液备用。结果显示,第15和20 d试验组大鼠的体质量高于对照组(P<0.01);去除体质量的影响后,试验组大鼠子宫的质量显著高于对照组(P<0.01),第5和10d卵巢质量显著高于对照组(P<0.01)。试验组血清AMH和雄激素(T)显著高于对照组(P<0.01或P<0.05),第15和20 d血清P以及第20d血清LH和E2试验组均显著高于对照组(P<0.01或P<0.05)。试验组卵巢AMH mRNA表达量高于对照组,第5和10d表达量差异显著(P<0.05)。不同日龄大鼠脏器指数动态变化提示,试验组大鼠卵巢、子宫等器官在性发育早期得到优先发育;血清AMH含量变化对外源性激素敏感,变化时间早于其他血清激素,可以作为检测PCOS疾病发生的辅助指标。三PCOS大鼠AMH及其受体基因mRNA表达分析采用RT-PCR和实时荧光定量PCR技术对大鼠卵巢PCOS形成过程中AMH、AMHR2和AMHR-SV1mRNA在卵巢组织中的表达水平进行分析,结果如下:1.试验组与对照组变化趋势相同,在第10d短暂升高,随后下降。试验组与对照组比较,试验组卵巢AMH mRNA表达量在第5和10天显著高于对照组(P<0.01)。2.试验组AMHR2基因两种转录本表达趋势相同。与对照组比较,除第20天,表达量均低于对照组,AMHR2-SV1 mRNA表达量组间比较均差异显著(P>0.05 or P>0.01);AMH2-SV1表达量,从第5天开始下降直至第15天(P<0.05),第20天上升(P>0.05);不同时间段AMHR2-complatemRNA表达量始终高于AMHR2-SV1(P>0.05),但组内差异不显著(P>0.05)。结论:在一定时间内,外源性DHEA可能会促进AMH mRNA表达,造成血液AMH升高;对AMHR2 mRNA同时有抑制和促进作用,尤其对AMHR2-SV1影响显著,推断可能与PCOS发生相关。