研究背景和目的随着全球恶性肿瘤发病率的逐年递增,宫颈癌（Cervical Cancer）已在国内外女性生殖系统常见恶性肿瘤中高居第二位,并且其发病及死亡在全部女性恶性肿瘤中排名第四[1]。高危人乳头瘤病毒（HR-HPV）感染已被证实与宫颈癌、宫颈上皮内瘤变和口咽癌等疾病高度相关[2,3]。5-氨基酮戊酸介导的光动力疗法（ALA-PDT）作为一种极具前景的治疗手段,临床上已用于多种HR-HPV感染相关疾病,如持续性宫颈HR-HPV感染和宫颈癌、宫颈上皮内瘤变（CIN）、食管鳞癌、皮肤癌和尖锐湿疣等疾病的治疗[4]。然而,也有一些临床前研究发现,PDT治疗过程会诱导激活某些肿瘤抵抗通路（如NF-κB信号通路等）,从而导致肿瘤耐药[5]。双氢青蒿素（DHA）是青蒿素衍生物之一,具有良好的抗肿瘤活性,对宫颈癌、胰腺癌、白血病、骨肉瘤和肺癌等多种细胞均具有抑制作用[4,6-8]。目前研究表明,DHA可抑制NF-κB信号通路从而抑制肿瘤细胞增殖[9]。此外,有研究表明DHA对宫颈癌细胞系HeLa细胞有抑制作用,并且还可以增强宫颈癌HeLa和SiHA细胞对化疗的敏感性[10,11]。因此,我们推测DHA可能是克服ALA-PDT治疗HPV感染相关宫颈疾病耐药的措施之一。在此研究之前,还没有关于联合应用ALA-PDT和DHA来提高HR-HPV感染宫颈癌的临床疗效的研究。因此,本研究旨在体内外探讨ALA-PDT联合DHA治疗HR-HPV感染宫颈癌的疗效及其机制。方法1.ALA-PDT联合DHA对HeLa细胞活性和增殖的影响分别用不同浓度的DHA溶液和不同强度的照光能量刺激HeLa细胞。应用CCK-8法测定细胞活性,选择细胞存活率最接近50%（IC50）的处理条件作为后续实验的条件参数。设立分组:Control组,ALA-PDT组,DHA组,ALA-PDT+DHA组。CCK-8法和克隆形成实验检测各组细胞存活率和克隆形成;2.ALA-PDT联合DHA对HeLa细胞ROS生成和细胞凋亡的影响采用免疫荧光检测各组活性氧（ROS）生成情况;采用流式细胞术对各组细胞的凋亡水平进行检测;3.ALA-PDT联合DHA对HeLa细胞的调控机制生物信息学分析单纯PDT治疗调控抗肿瘤免疫的机制,免疫印迹法检测NF-κB/HIF-1α/VEGF 通路;4.ALA-PDT联合DHA对HeLa细胞裸鼠皮下移植瘤的作用体内构建宫颈癌HeLa细胞裸鼠皮下成瘤模型,分组、干预并观察统计肿瘤增殖情况,免疫组化法测定瘤体石蜡样本的ki-67的表达水平。结果1.ALA-PDT抑制HeLa细胞的细胞活性,且细胞活性呈照射剂量依赖性。细胞存活率最接近50%的处理条件为0.25mM ALA处理24 h,然后采用1.2 J/cm2的能量光照细胞后再培养24h;2.DHA抑制HeLa细胞的细胞活性,且细胞活性呈浓度依赖性。细胞存活率最接近50%的处理条件为30μM浓度DHA培养24h;3.DHA联合ALA-PDT可增强抑制HeLa细胞活性、增殖和克隆形成能力;4.ALA-PDT联合DHA显著增加HeLa细胞活性氧ROS生成量并促进细胞凋亡;5.生物信息学分析单纯PDT治疗诱导巨噬细胞激活某些促癌信号通路表达;6.DHA 抑制了 ALA-PDT 激活的 NF-κB/HIF-1 α/VEGF途径;7.体内实验表明DHA能增强ALA-PDT对裸鼠宫颈癌细胞增殖的抑制作用。结论ALA-PDT可降低HeLa细胞的存活率和长时间增殖,并促进活性氧ROS生成及诱导细胞凋亡,联合应用DHA可增强ALA-PDT的上述作用。DHA能抑制ALA激活的NF-κB/HIF-1 α/VEGF途径以增强抗肿瘤免疫作用。体内实验同样证实了 DHA能有效增强ALA-PDT治疗HR-HPV感染宫颈癌的疗效。