论文部分内容阅读
镉是一种广泛存在的环境污染物,1993年国际癌症研究机构(IARC)已将其列为确切的人类致癌物(IA).有关镉的致癌作用,近年来在分子水平上展开了广泛的研究,涉及到DNA损伤、基因调节和细胞信号传导、细胞凋亡等方面.越来越多的实验表明诱导氧化损伤是镉引起癌变和细胞毒性的一个重要机制.当给予Vit-C、Vit-E、GSH或GSH-Px等抗氧化剂,可有效拮抗镉的致癌作用和细胞毒性.基于已有研究结果,推测在一定条件下,如果增加正常细胞中GST-Pi的水平,有可能在对抗和消除镉的致癌和细胞毒性中起重要作用.该研究第二部分的工作是从细胞水平探讨转导并表达GST-Pi基因后对镉抑制细胞增殖作用的影响,为深入了解GST-Pi在肿瘤预防中的作用提供参考.研究方法:一、hGSTs GSTM1、T1、P1多态性基因型检测与验证 1、GSTM1、T1、P1多态性基因型的检测:随机抽取该课题组其它分题用PCR-RFLP技术检测过的样本提取基因组DNA,用双重PCR判定GSTM1、T1是否为缺失基因型;常规PCR扩增GSTP1基因,将检测结果与先前检测结果进行比较,同时选择GSTM1、GSTT1非缺失基因型和GSTP1样本用于T载体克隆及测序.2、T载体克隆及鉴定:目的基因与T载体连接后,转导入感受态细胞DH5α扩增、提纯质粒.以质粒DNA为模板,通过PCR扩增和限制性酶切鉴定T载体克隆是否成功.3、测序:将含有目的片段的质粒DNA双向测序,以鉴定目的片段是否插入T载体及确定其基因型.4、两种方法学检测结果比较:将该研究用PCR扩增及T载体克隆、测序方法检测结果与该课题组用PCR-RFLP检测方法所得结果相比较,了解该课题组建立的基因多态性检测反应体系的准确性、可靠性及可重复性.二、GSTPi对镉细胞毒性影响的买验研究 1、镉对NIH3T3细胞生长抑制作用研究:选择NIH3T3细胞给予0.1625μmo1·L<-1>~80μmol·L<-1>的氯化镉,采用噻唑兰(MTT)颜色反应法检测6~24hrs的细胞增殖功能,了解镉对NIH3T3细胞生长抑制作用的剂量-效应关系和时间-效应关系,为进一步研究镉对GSTPi表达的NIH3T3-Pi细胞生长抑制作用寻找染毒剂量等依据.2、GSTPi cDNA绿色荧光蛋白真核表达载体构建:提取人鼻咽癌细胞CNE1、CNE2总RNA,通过逆转录一聚合酶链式反应扩增GSTPi基因cDNA全序列,经T载体克隆后利用基因重组技术将该基因序列插入绿色荧光蛋白表达载体,构建GSTPi cDNA绿色荧光蛋白真核表达载体,用于转染细胞.3、GSTPi表达细胞建立:应用真核细胞转染方法将GSTPi cDNA表达载体导入NIH3T3细胞,获得GSTPi表达细胞.经荧光显微镜观察转染细胞、免疫组化检测GSTPi表达情况.4、GSTPi对镉细胞毒性影响的研究:GSTPi表达细胞NIH3T3-Pi和GSTPi低表达细胞NIH3T3-N1给予0.1625μmol·L<-1>~10μmol·L<-1>镉染毒,采用噻唑兰(MTT)颜色反应法检测6hrs、12hrs的细胞增殖功能,了解镉对GSTPi表达细胞生长抑制作用的剂量-效应关系和时间-效应关系,探讨GSTPi对镉细胞毒性影响.