第一部分Notchl胞内区(Notchl-IC)对EGFR阳性乳腺癌细胞生物学行为的影响研究背景：乳腺癌是严重威胁女性健康的恶性疾患,是导致女性死亡的主要原因之一。阐明乳腺癌发生发展的分子机制对于探讨新的起协同作用的和更有效的联合治疗方案具有重要意义。细胞的增殖分化过程受多种因素的影响,其异常将导致多种疾病及肿瘤的发生。探讨肿瘤细胞异常的周期调控机制对于阐明肿瘤的发生发展并最终克服肿瘤具有重要意义。Notch信号是在进化中高度保守的信号传导系统,广泛存在于哺乳动物和无脊椎动物中,由Notch受体(Notch 1-4)、Notch配体(Delta-like 1、3-4和Jagged 1-2)及细胞内效应分子(CSL蛋白：CBF1/Su(H)/LAG-1)组成。Notch受体为一组高度保守的跨膜蛋白质,由胞外区、跨膜区和胞内区组成。Notch配体通过与相邻的同型或异型细胞表面的Notch分子胞外区结合而激活Notch分子,释放具有活性的Notch胞内区(Notch-IC)。Notch-IC进而转移到细胞核内,通过CSL等途径,促进Notch目标基因的转录。Notch信号在乳腺肿瘤中的作用最初是由于在CzechⅡ鼠中发现MMTV的插入座位而提出。在Notch1、Notch4基因中均发现了MMTV前病毒的插入,产生异常活化的Notch信号,导致鼠乳腺上皮的转化及乳腺腺癌的发生,提示Notch信号在乳腺癌的发生发展中发挥重要作用。但是,Notch信号在人乳腺发育及肿瘤中的作用研究较少。探讨Notch信号在人类乳腺癌中的表达活化情况及其在乳腺癌发展中的具体作用对于阐明人乳腺癌的发生发展具有重要意义,可以为人乳腺癌的治疗提供理论依据。研究目的：构建携带Notchl-IC的逆转录病毒载体,将其转染EGFR阳性的乳腺癌细胞系MDA-MB-231,筛选出表达Notch1活化胞内区的单克隆细胞系MDA-MB-231-ICN,检测外源性Notch1信号对乳腺癌细胞生物学行为的影响,探讨Notch1信号在乳腺癌发生发展中的作用。研究方法：1.逆转录病毒的包装及单克隆细胞系的筛选1.1逆转录病毒的包装采用碱裂解法提取质粒DNA(包括包膜质粒pCMV-VSV-G、包装质粒pKat和目的基因质粒pMSCV-ICN/GFP)。采用磷酸钙-DNA共沉淀法,将包膜质粒、包装质粒和目的基因质粒共转染HEK293T细胞,构建逆转录病毒并收集病毒上清。1.2单克隆细胞系的筛选用逆转录病毒感染乳腺癌细胞系MDA-MB-231,收集逆转录病毒感染72h后的MDA-MB-231细胞,限制性稀释法筛选出表达Notch 1活化胞内区的阳性单克隆细胞系MDA-MB-231-ICN.2. Notch1胞内区(Notchl-IC)对EGFR阳性乳腺癌细胞生物学行为的影响2.1乳腺癌细胞转染Notch1-IC后,Notchl信号的表达检测应用Real-time RT-PCR技术检测]Notchl及其下游效应基因mRNA水平表达情况的改变,应用Western blot检测相应基因蛋白水平表达情况的改变。2.2 Notch1信号对乳腺癌细胞的增殖检测应用MTT方法检测乳腺癌细胞系的增殖情况,应用PI染色流式细胞术检测细胞周期分布,应用Real-time RT-PCR技术检测细胞周期相关蛋白CyclinD、CDK2、P21基因mRNA水平表达情况的改变,应用Western blot检测相应基因蛋白水平表达情况的改变,应用Annexin V/ PI染色流式细胞术检测细胞早期凋亡和晚期凋亡情况。研究结果：1.逆转录病毒的包装及单克隆细胞系的筛选1.1逆转录病毒的包装HEK293T细胞为有效的逆转录病毒包装细胞,质粒共转染后可产生高滴度病毒。我们成功转染HEK293T细胞,发现48-72h荧光强度最高,于此时收集病毒上清,备用。1.2单克隆细胞系的筛选逆转录病毒感染MDA-MB-231细胞72h后,其荧光强度最高,收集此时的细胞,采用限制性稀释法筛选阳性单克隆细胞系。成功筛选出稳定表达Notchl活化胞内段的单克隆细胞系MDA-MB-231-ICN.2.Notchl胞内区(Notch 1-IC)对EGFR阳性乳腺癌细胞生物学行为的影响2.1乳腺癌细胞转染Notch1-IC后,Notch1信号的表达增强Real-time PCR结果显示,MDA-MB-231-ICN细胞Notchl基因在mRNA水平的表达高于MDA-MB-231细胞,提示转染后外源性Notchl信号可以促进Notchl基因的转录。Western blot的结果与Real-time PCR结果一致,提示Notch1蛋白的表达增加。Notchl下游效应基因Hesl在mRNA和蛋白水平的表达均增加,提示Notch1信号的活化。Notch1下游效应基因Heyl的表达也增加,进一步证实Notch1信号的活化。2.2 Notchl信号促进乳腺癌细胞的增殖MTT结果显示,MDA-MB-231-ICN细胞的增殖速度高于MDA-MB-231细胞。细胞周期分析结果显示,MDA-MB-231-ICN细胞Go期的细胞显著低于MDA-MB-231细胞,提示细胞周期的进展。细胞周期相关蛋白的检测发现,与MDA-MB-231细胞相比,MDA-MB-231-ICN细胞CyclinD和CDK2在mRNA水平的表达均增加,而P21的表达降低,蛋白水平的表达结果与]mRNA的结果一致,即CyclinD和CDK2蛋白的表达增加,而P21蛋白的表达降低。细胞周期相关蛋白的检测结果支持细胞周期分布的变化。细胞凋亡分析结果显不,MDA-MB-231-ICN细胞的早期凋亡和晚期凋亡率均低于MDA-MB-231细胞。结论：我们通过构建携带Notch1-IC的逆转录病毒载体,将其转染EGFR阳性的乳腺癌细胞系MDA-MB-231,成功筛选出表达Notchl活化胞内区的阳性单克隆细胞系MDA-MB-231-ICN,结果显示转染后Notchl信号的表达和活化增加。高表达的Notchl信号促进乳腺癌细胞系的增殖,抑制细胞凋亡,促进细胞周期进展,表明Notchl信号在乳腺癌的发生发展过程中发挥重要的促进作用。本研究对阐明人乳腺癌的发病机制具有重要作用。第二部分EGFR联合Notchl信号在EGFR阳性乳腺癌发生中的作用研究背景：细胞的增殖分化过程受多种信号通路的调控,他们之间不是孤立的发挥作用,而是在一个复杂的细胞信号网络中相互作用,共同调节细胞的各项生命活动。研究肿瘤细胞异常的周期调控机制对于阐明肿瘤的发生发展机制并最终克服肿瘤具有重要意义。Notch和EGFR信号转导系统普遍存在于机体组织细胞中,二者相互关联,精确调控细胞周期进展。Notch和EGFR信号在肿瘤发病机制中的作用已成为研究重点。Notch信号系统广泛存在于哺乳动物和无脊椎动物中,在进化中高度保守。Notch受体活化后,释放具有活性的Notch胞内区,Notch-IC转移到细胞核内,激活包括Hes在内的效应器,抑制分化相关基因的转录,最终达到抑制细胞分化、使细胞保持较原始阶段的目的。EGFR信号是机体的另一条重要信号转导途径,广泛存在于上皮、间质及神经组织,贯穿于整个细胞的生长和增殖过程,对细胞的分化选择起重要的调节作用。EGFR家族主要包括EGFR(即HER1)和HER2-4。EGFR信号经受体酪氨酸磷酸化被激活,通过Ras/Raf/MEK/MAPK途径级联放大,最后导致MAPK的磷酸化,修饰的MAPK信号进入细胞核,促进目标基因的磷酸化,调节基因的表达和活性。EGFR信号与肿瘤的发生发展及预后密切相关,在多种肿瘤如肺癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌及膀胱癌等中均有表达。高表达的EGFR信号可以促进肿瘤细胞的增殖,新生血管的形成,肿瘤的侵袭和转移等。患者常对化疗药物发生抵抗,预后较差。以EGFR为靶点的研究结果已有报道,EGFR反义RNA体外可以抑制细胞的增殖,诱导细胞凋亡。EGFR抑制剂可以引起卵巢癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌及前列腺癌等多种肿瘤细胞生长受抑,起到抑癌的作用,并且EGFR抑制剂可以增强多种抗肿瘤药物的细胞毒作用。在乳腺癌中,Notch与EGFR信号的相互作用还不清楚。本研究预期目标的实现将会明确EGFR信号在恶性乳腺癌中的作用,阐明乳腺癌中Notch1和EGFR信号的相互关系,进一步揭示恶性肿瘤发生发展的机制,为肿瘤的基因治疗提供实验依据。研究目的：应用EGFR抑制剂gefitinib来抑制EGFR的信号活性,探讨EGFR信号对人乳腺癌细胞系生物学活性的影响,揭示EGFR与Notch1信号间的相互作用及机制。研究方法：1. EGFR抑制剂对乳腺癌细胞生物学行为的影响及机制1.1 EGFR抑制剂对乳腺癌细胞生物学行为的影响选用人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7为研究对象,在EGFR抑制剂使用前后,应用MTT方法检测乳腺癌细胞系的增殖情况,应用PI染色流式细胞术检测细胞周期分布,应用Annexin V/ PI染色流式细胞术检测细胞早期凋亡和晚期凋亡情况。1.2 EGFR抑制剂对Notch1和EGFR信号表达的影响应用Real-time RT-PCR技术检测EGFR抑制剂使用前后Notch 1和EGFR mRNA水平表达情况的改变。2. Notch1与EGFR信号在乳腺癌发生中的相互作用选用MDA-MB-231细胞和MDA-MB-231-ICN细胞为研究对象,比较EGFR抑制剂使用前后乳腺癌细胞生物学活性的改变。应用MTT方法检测乳腺癌细胞系的增殖情况,应用PI染色流式细胞术检测细胞周期分布,应用Real-time RT-PCR技术检测Notch 1和EGFR以及细胞周期相关蛋白CyclinD、CDK2、P21基因mRNA水平表达情况的改变,应用Annexin V/PI染色流式细胞术检测细胞早期凋亡和晚期凋亡情况。研究结果：1.EGFR抑制剂对乳腺癌细胞生物学行为的影响及机制1.1 EGFR抑制剂对乳腺癌细胞生物学行为的影响与DMSO溶剂对照相比,使用EGFR抑制剂后,MTT结果显示乳腺癌细胞的增殖均降低,细胞周期分析结果显示乳腺癌细胞Go/G1期的细胞比率均显著升高,细胞凋亡分析结果显示乳腺癌细胞的早期和晚期凋亡率均增加。1.2 EGFR抑制剂对Notch1和EGFR信号表达的影响Real-time PCR的结果显示使用EGFR抑制剂后,MDA-MB-231和MCF-7细胞中Notch1和EGFR的表达均降低,表明EGFR信号的活性降低,提示EGFR与Notch1信号存在相互作用。2. Notchl与EGFR信号在乳腺癌发生中的相互作用Real-time PCR的结果显示使用EGFR抑制剂后,MDA-MB-231和MDA-MB-231-ICN细胞中Notch1和EGFR的表达均降低,但Notch1和EGFR在MDA-MB-231-ICN细胞中降低的幅度低于相应的MDA-MB-231细胞。MTT结果显示使用EGFR抑制剂后,MDA-MB-231和MDA-MB-231-ICN细胞的增殖均低于溶剂对照,但MDA-MB-231-ICN细胞的增殖速度高于相应的MDA-MB-231细胞。细胞周期分析结果显示使用EGFR抑制剂后,MDA-MB-231和MDA-MB-231-ICN细胞G0/G1期的细胞均显著高于溶剂对照,但MDA-MB-231-ICNG0/G1期的细胞仍低于相应的MDA-MB-231 G0/G1期细胞。细胞周期相关蛋白的检测发现使用EGFR抑制剂后,MDA-MB-231和MDA-MB-231-ICN细胞CyclinD和CDK2在mRNA水平的表达均降低,而P21的表达升高。细胞凋亡分析结果显示,MDA-MB-231和MDA-MB-231-ICN细胞的早期凋亡和晚期凋亡率均增加,但MDA-MB-231-ICN细胞的早期凋亡和晚期凋亡率均低于相应的MDA-MB-231细胞。结论：EGFR抑制剂抑制人乳腺癌细胞系的增殖,导致细胞周期阻滞和细胞凋亡增加,提示EGFR信号在人乳腺癌中发挥正调控作用。活化的Notch1信号可以部分逆转EGFR抑制剂对乳腺癌细胞的细胞毒作用,提示在乳腺癌的发生发展中,Notch1和EGFR发挥协同促进作用。本研究对阐明人乳腺癌的发病机制具有重要作用,为探讨人乳腺癌的临床治疗新方法提供新的理论依据。