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目的：通过建立伤寒沙门菌(Salmonella enterica serovar Typhi, S.typhi)感染的细胞模型,用自噬阻断剂氯喹(chloroquine, CQ)和Beclin1过表达技术,研究伤寒沙门菌质粒pRST98对人巨噬细胞THP-1自噬、凋亡和炎症反应的影响,为进一步阐明该质粒增强宿主菌毒力的分子机制提供理论和实验依据。方法：一、伤寒沙门菌质粒对巨噬细胞THP-1自噬过程的影响1.CQ对THP-1细胞自噬阻断浓度的确定CQ是一种治疗疟疾的药物,近年来被广泛用作自噬阻断剂,它通过提高溶酶体的pH值使酸性水解酶失活,导致自噬溶酶体无法分解底物,造成自噬相关蛋白的累积。本实验以0、10、20、30、40、50、60、70和80μM CQ的培养液作用THP-1细胞6h,用蛋白质印迹技术(western blot, WB)检测自噬底物蛋白p62的累积水平;作用细胞24h后,用噻唑蓝还原法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)检测细胞存活率。2.CQ对受试菌的影响用上述方法测定的CQ适宜浓度作用受试菌24h,OD600测定菌液浓度,检测该浓度CQ对细菌的影响。3.CQ对THP-1细胞感染模型自噬的影响由于伤寒沙门菌只感染人类的严格宿主特异性,本实验以携带伤寒沙门菌质粒pRST98的野生株ST8、消除pRST98的突变株ST8-ΔpRST98和将pRST98经接合转移重新导入的回补株ST8-c-pRST98为受试菌,分别与人巨噬细胞THP-1共培养建立感染模型。用对数生长期细菌按感染复数(multiplicity of infection, MOI)50：1感染细胞,同时设立自噬阻断剂CQ干预组。将细菌与细胞共作用1h后吸取上清,加入含100μg/ml的阿米卡星(amikacin, AMK)培养液作用2h以去除胞外菌,将AMK浓度降为10μg/ml以抑制从感染细胞中释放至培养液中的细菌生长。分别在感染的1h和3h收获细胞：①WB检测细胞自噬标志蛋白——微管相关蛋白1轻链-Ⅱ (microtubule-associated protein1light chain3-II,MAP1-LC3-II)及自噬底物蛋白p62表达;②将带有红色和绿色荧光的mRFP-GFP-LC3质粒转染THP-1细胞后,用共聚焦激光扫描显微镜(confocal laser scanning microscope, CLSM)观察细胞自噬体及自噬溶酶体的变化。二、伤寒沙门菌质粒对巨噬细胞THP-1凋亡和炎症反应的影响beclin1基因是第一个被确认的哺乳动物自噬调控基因,其编码产物Beclin1是自噬发生的标志蛋白。本部分实验用脂质体转染法将外源性beclin1基因导入THP-1细胞,研究Beclin1蛋白过表达后伤寒沙门菌质粒对巨噬细胞凋亡及炎症反应的影响。感染模型建立同第一部分,分别设野生株ST8、突变株ST8-ApRST98和回补株ST8-c-pRST98感染的Beclin1过表达组及对照组,共6组。在感染后1h、3h、5h、9h和13h收获细胞：①WB检测质粒转染后Beclin1表达效率;②Annexin.V-FITC/Propidium Iodide (Ann.V/PI)双染流式细胞术(flow cytometry,FCM)分析细胞凋亡率;③酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assayELISA)检测细胞因子白细胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、白细胞介素-18(interleukin-18, IL-18)和白细胞介素-10(interleukin-10, IL-10)。结果：一、伤寒沙门菌质粒对巨噬细胞THP-1自噬过程的影响1.WB检测自噬底物蛋白p62结果显示,30μMCQ作用THP-1细胞6h后,p62已出现明显累积(p<0.01),40μMCQ作用细胞6h后,累积程度达到饱和。MTT法检测结果显示，30μM和40μMCQ作用细胞24h后存活率分别为58.58%和46.03%。2.OD600测定菌液浓度结果显示,与对照组相比,30μMCQ对3株受试菌菌量未见明显影响。参照文献,30μMCQ作用THP-1细胞6h,自噬底物蛋白p62出现明显累积,作用细胞24h后,细胞存活率超过50%,且对细菌未见明显影响,因此将30μM作为CQ的后续工作浓度。3.WB检测自噬标志蛋白LC3-Ⅱ和底物蛋白p62结果显示,细菌与细胞共作用1h,CQ干预组LC3-Ⅱ/β-actin值及p62/β-actin值明显高于对照组(p<0.01),其中突变株ST8-ApRST98LC3-Ⅱ/β-actin值及p62/β-actin值的增加量均高于野生株ST8及回补株ST8-c-pRST98(p<0.05)。细菌与细胞共作用3h,CQ干预组LC3-Ⅱ/β-actin值及p62/β-actin值较对照组上升(p<0.05),但突变株ST8-ΔpRST98的上升量仍显著高于野生株ST8及回补株ST8-c-pRST98(P<0.01)。4.用mRFP-GFP-LC3质粒转染THP-1细胞后,CLSM检测结果显示,细菌与细胞共作用1h,CQ干预组突变株ST8-ΔpRST98感染细胞的点状聚集物数量高于对照组,而野生株ST8和回补株ST8-c-pRST98感染细胞中未见显著差异。细菌与细胞共作用3h,CQ干预组3株菌感染细胞的点状聚集物数量均高于对照组,其中突变株ST8-ΔpRST98的上升量显著高于野生株ST8及回补株ST8-c-pRST98(P<0.01)。二、伤寒沙门菌质粒对巨噬细胞THP-1凋亡和炎症反应的影响1.FCM检测细胞凋亡率结果显示,Beclin1蛋白过表达组,在细菌与细胞共作用的1h、3h、5h和9h,野生株ST8、回补株ST8-c-pRST98及突变株ST8-ΔpRST98感染THP-1细胞的凋亡率均上升;细菌与细胞共作用13h,野生株、回补株与突变株感染THP-1的凋亡率未见显著性差异。对照组在细菌与细胞共作用的1h和3h,凋亡率未见显著差异。细菌与细胞共作用5h、9h和13h,突变株ST8-ΔpRST98感染THP-1细胞凋亡率低于野生株ST8和回补株ST8-c-pRST98感染组(p<0.05),且随时间延长愈加明显。2.ELISA检测细胞因子结果显示,细菌和细胞共作用1h、3h和5h,Beclin1过表达组及对照组突变株感染细胞的IL-1β及IL-18表达水平高于野生株和回补株(p<0.05),而突变株感染细胞的IL-10表达水平低于野生株和回补株(p<0.05)。但细菌与细胞共作用9h后,野生株、回补株与突变株感染细胞的IL-1β、IL-18和IL-10表达水平未见显著差异。细菌和细胞共作用1h、3h和5h,Beclin1蛋白过表达组较对照组3株受试菌感染THP-1细胞的IL-1β及IL-18表达水平上升,而IL-10表达水平下降。细菌与细胞共作用9h,3株受试菌感染THP-1细胞IL-1β、IL-18和IL-10表达水平未见显著差异。结论：1.CQ干预前后,比较THP-1细胞自噬过程中自噬标志蛋白LC3-Ⅱ、底物蛋白p62、自噬体和自噬溶酶体的实验结果显示伤寒沙门菌质粒pRST98作用在THP-1细胞自噬过程的前期,早于溶酶体降解的过程。2. Beclin1作为自噬标志蛋白,过表达后可上调沙门菌感染细胞的自噬水平及凋亡率,加剧细胞炎症反应并最终影响感染的结局。