[研究背景]： 前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤之一，死亡率高居男性癌性死亡的第二位。发病隐匿和易转移是临床诊断和治疗前列腺癌的最大障碍。目前前列腺癌的病因尚不明确，可能与遗传、环境和性激素等多因素有关。前列腺癌特异膜标志物是实现生物诊断和生物治疗的基础，探索前列腺癌特异膜标志物在前列腺癌发生发展中的作用机制十分重要。 前列腺特异膜抗原(prostate-specific membrane antigen，PSMA)主要表达于前列腺上皮细胞膜表面，具有较高的前列腺癌特异性和膜结合特性，是近年来前列腺癌研究热点之一。PSMA是一种Ⅱ型跨膜糖蛋白，具有叶酸水解酶活性和NAALADase酶活性。PSMA在正常前列腺中低表达，在大多数前列腺癌组织中高表达，并随肿瘤进展而表达增高，在转移癌及激素不敏感型前列腺癌中表达进一步增高，提示PSMA可能与肿瘤的发生发展相关，但PSMA在前列腺癌中的具体作用及机制尚不明了。相关研究提示PSMA可能与前列腺癌的生长侵袭有关。 选择剪接是转录后修饰的一个普遍现象，是产生蛋白质多样化的重要机制之一，与人类多种疾病包括肿瘤的发生发展密切相关。PSMA也存在多种选择剪接形式。PSMA5是本课题组近期发现的PSMA新型剪接变异体，具有较高的前列腺癌特异性，不仅在基因结构和蛋白质组成上与PSMA存在明显差异，而且在前列腺病变特异性上也与PSMA不同，两者是否在功能上也不一致还有待于进一步实验加以证实。 [目的]： 1.验证PSMA新型剪接变异体(PSMA5)能否表达完整的功能蛋白。 2.研究PSMA及PSMA5对前列腺癌细胞的生物学行为影响，比较二者有无差异，为PSMA及其剪接变异体的功能研究提供技术方法和物质基础，为进一步研究PSMA及其剪接变异体在前列腺癌的发生发展机制中的作用提供新的视野。 [方法]： 1.本研究在前期工作基础上，以本实验室保存的pMD18T-PSMA和pMD18T-PSMA5质粒为模板，PCR扩增分别包含PSMA和PSMA5的完整开放读码框架的目的基因片段，构建两个真核表达载体pcDNA3.0/PSMA和pcDNA3.0/PSMA5，经双酶切和碱基测序鉴定。 2.将鉴定阳性的pcDNA3.0-PSMA和lpcDNA3.0-PSMA5分别转染模型细胞PC-3，转染pcDNA3.0空质粒作为阴性对照。G418筛选转染细胞，RF-PCR、间接免疫荧光和免疫印迹分别从基因水平和蛋白水平鉴定G418抗性细胞中有无目的蛋白表达。 3.利甩PSMA和PSMA5蛋白表达阳性的PC-3细胞进行体外功能实验，包括绘制生长曲线、划痕实验、侵袭实验，比较空质粒转染前后、重组质粒组与空质粒组及PSMA/PC-3和PSMA5/PC-3对PC-3细胞的生物学行为影响有无差异。 [结果]： 1.测序结果表明目的片段在pcDNA3.0质粒中插入方向正确，序列与模板100﹪同源，说明pcDNA3.0-PSMA及pcDNA3.0-PSMA5真核表达载体构建成功。 2.筛选出的G418抗性细胞克隆扩增后，RT-PCR鉴定结果：PSMA及PSMA5特异性引物分别可从PSMA/PC-3细胞和：PSMA5/PC-3细胞来源的cDNA中扩出目的片段，而以pcDNA3.0/PC-3细胞来源的cDNA为模板只能扩出内参，无其他条带扩出。说明PSMA和PSMA5在基因水平上有转录。免疫荧光结果：PSMA/PC-3、PSMA5/PC-3细胞均发出绿色荧光；免疫印迹结果：裂解两种细胞提取的蛋白和PSMA单抗结合可显示较弱条带，与阳性对照LNCaP细胞的目的蛋白条带位置相同或接近，说明重组质粒转染的PC-3细胞均有目的蛋白表达。 3.各组功能实验均以空质粒组为对照组，PSMA5/PC-3和PSMA/PC-3有生长减慢的趋势，但差异均无统计学意义(p>0.05)；PSMA/PC-3和PSMA5/PC-3的迁移速率相当，均慢于对照组，差异有统计学意义；侵袭实验中PSMA/PC-3细胞的过膜细胞数最少，与空质粒对照组和IPSMA5/PC-3相比差异均有统计学意义，PSMA5/PC-3细胞的过膜细胞数比空质粒组细胞少，差异无统计学意义(p>0.05)。 [结论]： 1.成功构建了pcDNA3.0-PSMA和pcDNA3.0-PSMA5两个真核表达载体，获得PSMA和PSMA5表达阳性的PC-3细胞株，为相关功能实验提供物质基础。 2.证实PSMA5可在真核细胞表达膜蛋白，并具有良好的抗原性。 3.PSMA可抑制前列腺癌细胞PC-3的侵袭和迁移，PSMA5可抑制PC-3细胞的迁移，其侵袭抑制功能弱于PSMA。