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目的:研究骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的分离、体外培养、扩增的方法,对MSCs进行鉴定,观察骨髓干细胞的生物学特性。研究联合应用参芪通脉汤是否可以增强MSCs移植治疗大鼠后肢缺血的效果,并且探讨其可能的机制。方法:使用骨髓腔冲洗法采集大鼠骨髓血,通过密度梯度离心结合贴壁筛选法得到纯化的MSCs,在含有10%胎牛血清的低糖DMEM培养液中继续培养扩增MSCs。通过细胞形态、贴壁生长特性、流式细胞仪检测细胞CD29、CD44、CD11b、CD45的表达,对培养的MSCs进行鉴定。观察MSCs的细胞形态、生长速度、绘制MSCs的生长曲线、测定MSCs克隆形成率,冻存复苏MSCs后观察其存活率和生长状态。观察DAPI标记MSCs的效率和对MSCs生长状态的影响。Wistar大鼠24只,结扎右侧股动脉及其分支,制备成大鼠后肢动脉缺血模型,并随机分为3组,每组8只,分别是对照组、MSCs组和MSCs+中药组。股动脉结扎术后24h,MSCs组和MSCs+中药组大鼠给予含有MSCs (1×107 cells) DMEM 0.4ml注射于患肢缺血肌肉组织中,对照组的大鼠仅注射DMEM中药+MSCs组大鼠于股动脉结扎术后24h开始口服参芪通脉汤制剂,每天早晚各一次,连续3周。股动脉结扎术后第22d,行激光多谱勒血流灌注成像(laser Doppler perfusion imaging,LDPI)检查患肢血流灌注恢复情况,免疫组织化学染色检查VEGF在组织中的表达。结果:使用密度梯度离心结合贴壁筛选法可以得到高纯度的MSCs,MSCs可以通过体外培养大量扩增。通过本方法培养的MSCs贴壁生长,呈典型的梭形形状,漩涡状排列。流式细胞仪检测细胞表型CD29、CD44表达阳性,CD11b、CD45表达阴性,符合MSCs的特征。观察细胞生长特性发现:MSCs呈贴壁生长,原代培养9-12d可以达到90%融合,传代后的MSCs增殖速度较原代培养明显增快,第3代的MSCs已基本纯化。随着传代的增加,体外培养的MSCs生长增殖能力逐渐减弱,克隆形成率逐渐降低。冻存1个月和6个月后复苏的MSCs生存率分别为90%和85%,复苏后的细胞生长状态良好。DAPI标记MSCs的有效率为100%,标记48h后荧光显色无明显减弱,DAPI标记的MSCs的细胞形态和生长状态无明显变化。LDPI检查显示MSCs+中药组和MSCs组明显强于对照组(P<0.01),MSCs+中药组最强,免疫组织化学染色和计算机图像分析显示MSCs+中药组较MSCs组和对照组VEGF蛋白表达更强(P<0.05)。结论:密度梯度离心结合贴壁筛选法可以有效的获得纯化的MSCs,体外扩增MSCs是可行的。冻存对MSCs生长特性无明显影响。DAPI可以有效的标记MSCs细胞核,并且对MSCs的形态和生长状态无明显影响。应用MSCs+中药移植与MSCs组均可以促进血管新生、侧枝血管形成和增加缺血组织的血流灌注。联合应用参芪通脉汤可以明显增强MSCs移植治疗大鼠后肢缺血的效果。