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目的肺癌的发生是涉及多因素、多基因及多阶段的过程,其危险因素包括环境因素（大气污染、职业暴露等）、生物因素、行为与生活方式、遗传因素和肺部感染性疾病等。外泌体浓度及其蛋白在肺癌筛查中具有潜在应用价值,但缺乏有效的外泌体分离分析方法和外泌体肺癌分子标志。该研究以外泌体为研究对象,构建微流控芯片实现外泌体分离;采用蛋白组学和生物信息学等方法筛选和验证外泌体中肺癌候选蛋白标志物;以外泌体浓度和肺癌蛋白标志物为检测靶标,构建同步检测体系实现外泌体浓度及其蛋白定量测定。方法1.基于氧化锌-磁颗粒的Exo SIC芯片分离血浆外泌体采用水热法在二氧化硅磁珠表面原位生长氧化锌纳米线,制备氧化锌-磁颗粒（Zn O-MBs1）,将CD63适配体(Apt CD63)修饰于其表面形成Apt-Zn O-MBs1,用于特异性捕获外泌体。设计并制作不规则蛇形通道微流控芯片（Serpentine irregular channel microfluidic chip,Exo SIC）,利用芯片微结构促进Apt-Zn O-MBs1与外泌体混合,提高外泌体捕获效率。采用单因素实验法优化外泌体分离条件,并对芯片的混合效果、Apt-Zn O-MBs1回收率以及特异性进行考察;将所建立方法与差速离心法、共沉淀法等进行比较,并应用于血浆外泌体的分离分析。2.外泌体浓度及其膜蛋白EGFR和Ep CAM同步测定采用Apt-Zn O-MBs1捕获外泌体,设计三种荧光探针,分别结合外泌体表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor,EGFR）、上皮细胞粘附分子（Epithelial cell adhesion molecule,Ep CAM）及锚定磷脂双分子层。磁分离收集上清液,通过检测三种荧光探针信号强度,实现外泌体浓度、外泌体膜蛋白（EGFR和Ep CAM）的同步测定。采用单因素实验法优化检测条件并建立标准曲线。对方法的检出限、精密度、加标回收率和特异性进行考察;将该方法与纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle tracking analysis,NTA）和酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）进行比较,并应用于肺癌患者和健康对照人群血浆外泌体检测。3.外泌体中肺癌蛋白标志物的筛选及验证提取III/IV期肺癌患者（共7例,其中肺腺癌3例、肺鳞癌3例、小细胞肺癌1例）、肺良性疾病患者（共4例,其中肺部感染2例、肺间质性纤维化1例、慢性阻塞性肺疾病1例）和健康对照人群（共4例）的血浆外泌体。采用非标记蛋白组学技术对三组样品外泌体中的蛋白进行检测分析,筛选出差异表达蛋白;并通过平行反应监测（Parallel reaction monitoring,PRM）靶向定量蛋白组学验证差异表达蛋白,优选出潜在蛋白标志物;用Oncomine和GEPIA2数据库从基因层面上对潜在蛋白标志物进行验证,随后采用ELISA再进行验证。4.基于DNAzyme及CRISPR-Cas12a/Cas13a的外泌体蛋白SAA1和FV同步检测使用羧基磁珠（MBs2）为分离介质,在其表面修饰捕获抗体(Ab1SAA1和Ab1FV)制得多功能免疫磁珠MBs2@Ab1,用于捕获血清淀粉样蛋白A（Serum amyloid A-1 protein,SAA1）和凝血因子V（Coagulation factor V,FV）。加入检测抗体(Ab2SAA1和Ab2FV)与DNAzyme的结合物(Ab2SAA1-W1和Ab2FV-W2)形成双抗夹心结构。随后加入链霉亲和素磁珠（MBs3）和底物链（T1和T2）的复合物,即MBs3 Track。在Mg2+存在时,DNAzyme切割底物链产生短链P1和P2并释放到溶液中。两种短链分别激活Cas13a和Cas12a,进而切割溶液中的信号探针FQ1和FQ2,产生荧光信号。条件优化后,建立同步检测SAA1和FV的标准曲线;进一步考察方法的检出限、精密度、加标回收率和特异性;将该方法与ELISA进行比较,并将其应用于血浆外泌体的检测。结果1.基于氧化锌-磁颗粒的Exo SIC芯片分离血浆外泌体Zn O-MBs1直径约3μm,由二氧化硅磁珠和表面生长的六方纤锌矿结构氧化锌纳米线组成,其饱和磁化强度约为3.81 emu/g。在Zn O-MBs1表面修饰Apt CD63后,其Zeta电位转变为负电位,表明已制备出Apt-Zn O-MBs1。激光共聚焦成像及扫描电镜显示Apt-Zn O-MBs1能有效捕获外泌体。在Exo SIC中,Apt-Zn O-MBs1和外泌体可有效混合,且微囊泡对实验结果无明显干扰。Exo SIC中Apt-Zn O-MBs1回收率约为87%。该方法分离外泌体的产量为6.5×10~8particles/m L,是差速离心的24倍;分离外泌体的纯度与差速离心法相当,高于共沉淀法;与Apt-Zn O-MBs1在离心管中分离外泌体相比,其在Exo SIC芯片中分离外泌体效率更高。研究结果亦显示肺癌患者血浆外泌体浓度高于健康对照（P＜0.05）。2.外泌体浓度及其膜蛋白EGFR和Ep CAM同步测定扫描电镜及激光共聚焦成像结果显示三种荧光探针和Apt-Zn O-MBs1均能有效识别和捕获外泌体。荧光光谱表征结果显示三种荧光探针之间无明显干扰。该方法检测外泌体浓度及其膜蛋白EGFR和Ep CAM的范围分别为5×10~4～2.5×10~6 particles/μL、2.5～125.6 pg/m L和0.9～30.7 pg/m L;检出限分别为2.4×10~4particles/μL、0.96 pg/m L和0.19 pg/m L;加标回收率分别为105.17%～106.03%、85.71%～108.65%和91.39%～95.68%;RSD分别为3.85%～15.61%、1.91%～2.44%和13.51%～14.24%。血浆中与外泌体共存的微囊泡和蛋白对检测结果干扰较小,提示该方法特异性良好;该方法检测外泌体浓度与NTA结果一致（P＞0.05）,检测EGFR和Ep CAM浓度与ELISA结果具有相关性（P＜0.05）。此外,与ELISA相比,该方法可同步检测多种目标物,且不受可溶性蛋白干扰,检出限更低。实际样品检测结果显示,肺癌患者血浆外泌体浓度、EGFR和Ep CAM含量均高于健康对照（均P＜0.05）。3.外泌体肺癌蛋白标志物的筛选及验证非标记蛋白组学结果显示有24种蛋白仅存在于肺癌组。肺癌组与肺良性疾病和健康对照组相比,差异蛋白数目为187种,其中97种蛋白表达升高,90种蛋白表达降低。PRM靶向蛋白组学验证显示肺癌组8种蛋白表达上调。Oncomine和GEPIA2数据库验证结果显示在8种蛋白中,肺癌患者SAA1和FV基因表达上调。在此基础上,研究采用ELISA对实际样品中SAA1和FV的表达进行了再次验证。4.基于DNAzyme及CRISPR-Cas12a/Cas13a的外泌体蛋白SAA1和FV同步检测所建立方法检测SAA1和FV的浓度范围分别为0.1～30 ng/m L（7.39～220pmol/L）、1～50 ng/m L（3.03～151.52 pmol/L）;检出限分别为30 pg/m L和200pg/m L;加标回收率分别为93.20%～95.80%和94.20%～98.67%;RSD分别为7.10%～9.33%和7.16%～9.41%。特异性考察结果显示,血浆中常见的蛋白CEA、NSE以及Ig G对检测结果干扰较小。该方法检测外泌体裂解液中SAA1和FV含量与ELISA结果具有相关性（P＜0.05）。与ELISA相比,该方法不仅灵敏度较高,且能够同步检测两种蛋白。实际样品检测结果显示,肺癌患者血浆外泌体SAA1平均水平略高于健康对照,但差异无统计学意义（P＞0.05）,肺癌患者FV水平高于健康对照（P＜0.05）。结论1.依据外泌体生物学特性,制备出高效分离介质氧化锌-磁颗粒,并设计了具有蛇形不规则微通道结构的微流控芯片,联合应用氧化锌-磁颗粒介质和微流控芯片Exo SIC可分离血浆外泌体。基于适配体-氧化锌-磁颗粒和荧光探针的双重识别策略,构建了外泌体浓度及其膜蛋白EGFR和Ep CAM同步检测方法,实现了血浆外泌体的分离富集与定量检测。2.采用非标记蛋白组学筛选外泌体差异蛋白,经平行反应监测靶向蛋白组学、生物信息学和ELISA分层验证,提示SAA1和FV蛋白为候选肺癌标志物。运用DNAzyme及CRISPR-Cas12a/Cas13a双重放大检测信号,首次构建了灵敏度较高、特异性较强、普适性较好的血浆外泌体SAA1和FV同步检测方法。