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研究背景宫颈癌（cervical cancer,CC）是女性常见的恶性肿瘤,发病率呈逐年上升趋势,且新发宫颈癌的平均年龄降低,有年轻化趋势。因此,迫切需要寻找新的标志物能够预测宫颈癌的发展,并为其治疗提供新的生物学治疗靶点。环状RNA（circular RNA,circ RNA）是一种内源性非编码RNA,是由前体m RNA（precursor m RNA,pre-m RNA）经反向可变剪切而来的共价闭合且保守的单链转录本,没有5’-帽子和3’-poly（A）尾部,不容易被核酸酶降解,比线性RNA更稳定。circ RNA广泛存在于各种生物中,在多种生理和病理过程中发挥重要作用,其主要作用机制是以mi RNA sponge方式作为一种内源性竞争RNA（competing endogenous RNA,ce RNA）参与转录后调控调节m RNA的表达;或直接与蛋白质结合形成RNA-蛋白复合物,通过改变蛋白构象或参与基因表达调控影响蛋白质的功能进而发挥作用。研究发现circ SMARCA5（circ SWI/SNF related,matrix associated,actin dependent regulator of chromatin,subfamily a,member 5）在宫颈癌组织中表达下调,可能参与宫颈癌的进展,但其具体的作用机制有待进一步研究。葡萄球菌核酸结构域基因（Staphylococcal Nuclease Domain-containing 1,SND1）编码的SND1蛋白在多种癌症中表达上调,被定义为肿瘤蛋白,该蛋白可作为转录辅激活因子与基因的启动子区结合诱导基因转录,在多种癌症中发挥重要作用,但在宫颈癌中SND1影响肿瘤的分子机制尚不清楚。本课题收集50例宫颈癌患者的癌组织,以相应的癌旁组织作为对照检测宫颈癌组织中circ SMARCA5的表达水平,并对所有患者进行50个月的随访以明确circ SMARCA5的表达水平与宫颈癌患者生存预后的相关性。其次,进一步检测SND1在宫颈癌组织和细胞系中的表达水平,并研究对宫颈癌细胞功能的影响及其作用机制,随后,通过STRING数据库分析与SND1相互作用的蛋白YWHAB,并研究YWHAB在宫颈癌中所发挥的作用,探索circ SMARCA5对SND1及其互作蛋白YWHAB的影响。通过体外宫颈癌细胞实验明确circ SMARCA5对宫颈癌细胞增殖、凋亡和侵袭功能的影响及其作用机制是本课题研究的重点。最后,采用宫颈癌裸鼠移植瘤模型体内实验进一步验证circ SMARCA5是否在体内抑制宫颈癌的生长。本研究希望能够找到新的标志物预测宫颈癌的发展,并为其治疗提供新的靶点。本论文主要分为以下四个部分:第一部分:宫颈癌组织中circ SMARCA5的表达水平与宫颈癌患者生存预后的关系;第二部分:circ SMARCA5调节宫颈癌细胞增殖、凋亡和侵袭能力的机制;第三部分:SND1调节宫颈癌细胞增殖、凋亡和侵袭能力的机制;第四部分:circ SMARCA5对宫颈癌荷瘤小鼠肿瘤组织的生长作用。第一部分宫颈癌组织中circ SMARCA5的表达水平与宫颈癌患者生存预后的关系目的1.检测宫颈癌鳞癌患者的癌组织和相应的癌旁组织中circ SMARCA5的表达水平;2.明确circ SMARCA5的表达水平与患者预后的相关性。方法1.收集2015年6月至2017年6月在郑州大学第二附属医院行手术治疗的50例宫颈癌患者（年龄44.52±10.73岁）的宫颈癌组织和邻近正常组织作为样本,所有患者均接受50个月的随访;2.采用定量逆转录PCR技术（quantitative reverse transcription PCR,RT-q PCR）检测组织中circ SMARCA5的表达水平;3.收集宫颈癌患者的临床病理资料,分析circ SMARCA5的表达水平与宫颈癌临床病理参数的相关性;4.通过SPSS 23.0和Graph Pad Prism 7.0软件进行数据的统计和分析,所有数据以平均值±标准偏差（（?）±s）表示,数据行正态分布。两组之间的数据比较采用独立样本t检验,多组之间的比较使用方差分析。采用Kaplan Meier法和log-rank检验对宫颈癌患者进行生存分析。结果1.宫颈癌患者癌组织中circ SMARCA5的表达水平和癌旁组织标本相比显著下调,差异具有统计学意义（P＜0.0001）;2.低表达水平circ SMARCA5与FIGO分期、肿瘤细胞分化程度、肿瘤大小、间质浸润深度以及脉管间隙阳性显著相关;3.Kaplan Meier分析结果显示,高水平circ SMARCA5组病人较低水平组生存期长,差异有统计学意义（P=0.040）。结论circ SMARCA5在宫颈癌组织中表达水平下调,其表达水平与宫颈癌的生长和转移以及患者的生存预后具有明显的相关性。第二部分circ SMARCA5调节宫颈癌细胞增殖、凋亡和侵袭能力的机制目的1.探讨circ SMARCA5对宫颈癌细胞增殖、凋亡和侵袭能力的影响;2.明确circ SMARCA5与SND1之间的关系及调节机制;3.探讨circ SMARCA5是否通过影响SND1的表达参与调节宫颈癌细胞增殖、凋亡和侵袭。方法1.采用RT-q PCR检测宫颈癌患者癌组织和癌旁组织标本以及人正常宫颈细胞系Ect1/E6E7和癌细胞系（He La、HT-3、C33A和Ca Ski）中SND1的表达水平;2.采用Pearson相关系数分析宫颈癌患者宫颈组织中circ SMARCA5和SND1表达水平的相关性;3.过表达或敲低circ SMARCA5,通过细胞增殖与毒性检测试剂盒（Cell Counting Kit-8,CCK-8）、Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒、Transwell实验检测宫颈癌细胞增殖、凋亡和侵袭能力的变化;4.通过甲基化位点的预测进一步分析circ SMARCA5调节SND1表达的机制,通过甲基化特异性PCR（Methylation-specific PCR,MSP）检测SND1的甲基化水平,采用RNA结合蛋白免疫沉淀（RNA binding protein immunopreci-pitation,RIP）实验验证circ SMARCA5与DNMT3b的结合,通过染色质免疫沉淀（Chromatin immunoprecipitation,Ch IP）实验验证SND1启动子区域DNMT3b的富集;5.过表达或敲低SND1,通过CCK-8、Annexin V-FITC/PI、Transwell实验检测宫颈癌细胞增殖、凋亡和侵袭能力的变化;6.共转染circ SMARCA5过表达载体和SND1过表达载体,通过CCK-8、Annexin V-FITC/PI、Transwell实验检测宫颈癌细胞增殖、凋亡和侵袭能力的变化;7.通过SPSS 23.0和GraphPad Prism 7.0软件进行数据的统计和分析,所有数据以平均值±标准偏差（（?）±s）表示,数据行正态分布。两组之间的数据比较采用独立样本t检验,多组之间的比较使用方差分析。结果1.宫颈癌患者癌组织中SND1的表达水平和癌旁组织标本相比显著上调,差异具有统计学意义（P=0.0089）;2.Pearson相关系数分析显示circ SMARCA5的表达水平与SND1的表达水平呈负相关（r2=0.8031,P＜0.001）;3.与正常宫颈细胞系相比,circ SMARCA5在宫颈癌细胞系中的表达水平显著下调（P=0.0027）,SND1表达水平显著上调（P＜0.0001）,差异均具有统计学意义;4.过表达circ SMARCA5抑制宫颈癌细胞的增殖和侵袭,促进细胞凋亡;5.SND1启动子区存在Cp G岛,circ SMARCA5通过招募DNMT3b到SND1的启动子区域促进SND1的甲基化,下调SND1的表达;6.过表达SND1促进宫颈癌细胞增殖和侵袭,抑制细胞凋亡;7.过表达SND1能消除circ SMARCA5抑制宫颈癌细胞增殖和侵袭,促进细胞凋亡的能力。结论circ SMARCA5通过招募DNMT3b到SND1的启动子区域促进SND1的甲基化,下调SND1的表达,进而抑制宫颈癌细胞的增殖和侵袭,促进细胞凋亡。第三部分SND1调节宫颈癌细胞增殖、凋亡和侵袭能力的机制目的1.探讨SND1与YWHAB之间的相互作用;2.探讨circ SMARCA5是否通过调节SND1的表达影响SND1互作蛋白YWHAB,参与宫颈癌细胞增殖、凋亡、侵袭能力的调节。方法1.通过STRING在线数据库预测SND1的互作蛋白;2.采用RT-qPCR检测宫颈癌患者癌组织和癌旁组织标本以及人正常宫颈细胞系和宫颈癌细胞系中YWHAB的表达水平;3.采用Pearson相关系数分析宫颈癌患者宫颈组织中SND1和YWHAB表达水平的相关性;4.过表达或敲低YWHAB,通过CCK-8、Annexin V-FITC/PI、Transwell实验检测宫颈癌细胞增殖、凋亡和侵袭能力的变化;5.通过免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,Co-IP）实验验证SND1与YWHAB的相互作用;6.共转染SND1 siRNA和pcDNA-YWHAB,通过CCK-8、Annexin V-FITC/PI、Transwell实验检测宫颈癌细胞增殖、凋亡和侵袭能力的变化;7.共转染circ SMARCA5 si RNA和SND1 si RNA或共转染circ SMARCA5si RNA和YWHAB si RNA,通过CCK-8、Annexin V-FITC/PI、Transwell实验检测宫颈癌细胞增殖、凋亡和侵袭能力的变化;8.通过SPSS 23.0和GraphPad Prism 7.0软件进行数据的统计和分析,所有数据以平均值±标准偏差（（?）±s）表示,数据行正态分布。两组之间的数据比较采用独立样本t检验,多组之间的比较使用方差分析。结果1.宫颈癌患者癌组织中YWHAB的表达水平和癌旁组织标本相比显著上调,差异具有统计学意义（P=0.0037）;2.Pearson相关系数分析显示SND1的表达水平与YWHAB的表达水平呈正相关（r2=0.8700,P＜0.001）;3.过表达YWHAB促进宫颈癌细胞的增殖和侵袭,抑制细胞凋亡;4.SND1与YWHAB相互作用,过表达YWHAB能消除敲低SND1抑制宫颈癌细胞增殖和侵袭,促进细胞凋亡的能力;5.敲低SND1或YWHAB可逆转circ SMARCA5 si RNA对宫颈癌细胞增殖、侵袭的促进作用,对细胞凋亡的抑制作用。结论circ SMARCA5通过调节SND1的表达影响SND1互作蛋白YWHAB,参与宫颈癌细胞增殖、凋亡和侵袭能力的调节。第四部分circ SMARCA5对宫颈癌荷瘤小鼠肿瘤组织生长的作用目的构建宫颈癌裸鼠移植瘤模型,通过体内实验进一步验证circ SMARCA5是否抑制宫颈癌的生长。方法1.培养HeLa细胞,分别转染pLO-ci R-SMARCA5和空载体作对照;2.建立宫颈癌异种移植小鼠模型:将18只小鼠随机分为3组,在裸鼠背侧近右后肢皮下接种未经转染的He La细胞（空白对照组）,接种转染pLO-ci R空载体的He La细胞（pLO-ci R空载体对照组）,接种转染pLO-ci R-SMARCA5质粒的He La细胞（pLO-ci R-SMARCA5组）;3.注射后每周测量移植瘤的体积大小,持续28 d;4.28 d后,对小鼠实施安乐死,取出瘤体并测量肿瘤重量;5.采用Western blotting检测移植瘤组织中circ SMARCA5、SND1、YWHAB和抗凋亡蛋白Bcl-2、Survivin的表达水平;6.通过SPSS 23.0和Graph Pad Prism 7.0软件进行数据的统计和分析,所有数据以平均值±标准偏差（（?）±s）表示,数据行正态分布。两组之间的数据比较采用独立样本t检验,多组之间的比较使用方差分析。结果1.pLO-ciR-SMARCA5组肿瘤体积较pLO-ci R空载体对照组小,差异具有统计学意义（P=0.0015）;2.pLO-ciR-SMARCA5组肿瘤重量较pLO-ci R空载体对照组小,差异具有统计学意义（P=0.0002）;3.pLO-ciR-SMARCA5组与pLO-ci R空载体对照组相比,circ SMARCA5的表达水平升高（P=0.0002）,SND1（P=0.0002）、YWHAB（P=0.0001）和抗凋亡蛋白（Bcl-2,P=0.0002;Survivin,P＜0.0001）的表达水平降低,差异均具有统计学意义。结论在宫颈癌异种移植瘤小鼠模型中,circ SMARCA5明显抑制瘤体的形成和生长。