三维（3D）细胞培养技术是一种可以使细胞在体外条件下生长在三维空间中的培养方法,可以更好地模拟细胞在体内的生长状况和环境。3D培养方式下的细胞在细胞粘附、细胞凋亡、基因表达等方面均与2D培养不同。3D细胞培养既能保留天然细胞微环境的物理结构,又能提供细胞与细胞、细胞与基质之间的相互作用,为细胞水平的研究提供了一种更安全可靠的方法。水凝胶能给细胞提供营养并且能调节细胞的生长和分化,具有可塑性高,临床应用方便等优点,被广泛用作3D细胞培养的支架材料。3D细胞培养技术在药物发现和药理学应用、癌症生物学应用以及细胞活力研究等领域发挥着重要作用。在生物钟领域,细胞水平的研究有着至关重要的作用,但所用的培养方式通常是2D培养,缺乏3D培养方式的研究。本论文使用三种不同的水凝胶（Gelatin,Gel MA,HAMA-Gel MA）,以及这三种水凝胶的不同硬度（软,中,硬）对U2OS细胞进行3D培养,从凝胶类型、凝胶硬度两方面研究3D培养对U2OS细胞核心生物钟基因（bmal1,clock,cry1,cry2,per1,per2,per3）的影响。由时间扫描和频率扫描可知,储能模量（G’）大于损耗模量（G"）,且储能模量（G’）随着角频率的变化处于平稳的状态,说明这九种水凝胶交联成功,且稳定性好。由细胞活力检测结果可知,2D培养方式下的细胞呈拉伸状态,而3D培养方式下的细胞形态更接近体内,为球形。相比2D培养,3D培养方式使生物钟基因的表达均降低,除Gelatin水凝胶中的中凝胶和硬凝胶的bmal1基因,Gel MA水凝胶中的软凝胶的per1,per2基因,中凝胶中的per2基因,硬凝胶中的bmal1,per1,per2基因的表达与2D培养无明显差异。由生物钟基因的节律性表达可知,2D和3D培养方式下的生物钟基因的周期和相位无明显差异,除per1基因的振幅与2D相比无明显差异,其余生物钟基因的振幅与2D培养相比均降低。在Lumicycle上实时监测bmal1基因的表达可知,用Gel MA水凝胶的三种不同硬度对U2OS细胞进行3D培养,无论哪种硬度,bmal1基因的表达均比2D培养低,这与上述结果一致。这些结果表明,培养方式对生物钟基因的表达有明显影响,而水凝胶类型以及水凝胶的硬度对生物钟基因表达的影响不大。