牙齿再生具有重要的临床价值和科研意义,近年来愈发成为组织工程与再生医学在口腔医学领域的研究热点。多种牙源性间充质干细胞已被分离培养作为种子细胞用于牙体牙髓牙周乃至全牙再生的实验研究,其中人乳牙牙髓干细胞(SHED)因其较强的增殖能力、多向分化潜能及较易的获取途径成为组织工程与再生医学理想的种子细胞。课题组前期实验利用SHED细胞聚合体成功再生出了牙髓-牙本质复合体,并将其应用于完全脱位牙的再植治疗后取得了良好的牙周牙髓再生的治疗效果。临床上对众多牙齿缺失患者实现全牙再生是牙齿组织工程研究的最终目标,而能找到生物相容性好、无毒性刺激且能促进牙体组织再生的支架材料是至关重要的。近年研究发现牙本质和牙骨质作为天然的牙齿结构支架,不仅具有良好的生物相容性,而且牙质中包含的细胞生长因子和蛋白活性成分还能为种子细胞提供一个与牙生长发育相似的微环境,另外也易于获取。因此我们课题组希望借鉴骨组织工程制备支架材料常用的冷冻干燥法来处理牙齿,得到形态结构完整、低免疫原性并富含利于组织再生的诱导因子的冻干牙。本研究首先通过制备冻干牙并检测其生物学性能,明确其用于牙髓、牙周组织再生的可行性;进而采用冻干牙复合SHED细胞聚合体进行全牙异位移植和原位再植的动物实验,分析牙髓再生和牙周组织重建情况;最后开展一例临床前瞻性试验,评估自体冻干牙复合自体乳牙牙髓干细胞聚合体用于年轻恒牙完全脱位牙髓牙周再生治疗的预后,以期建立一种新的用于修复牙齿缺失的全牙再生方法,并为冻干牙及乳牙牙髓干细胞聚合体的临床转化应用提供研究基础和实验依据。第一部分冻干牙的制备及其生物学性能的实验研究目的:制备冻干牙并明确其生物学性能。方法:收集临床拔除的单根牙,通过牙体形态预备、脱脂、脱蛋白、冻干前预处理、冷冻干燥、消毒灭菌等过程完成冻干牙的制备;首先利用扫描电镜对其形态和结构进行观察并测试其机械性能;进而将人乳牙牙髓干细胞(SHED)接种到冻干牙片进行共同培养,扫描电镜观察细胞在不同时间段的形态变化,Hoechst细胞核染色后观察不同时间段牙片上细胞数目的变化,MTT法检测其对SHED细胞增殖能力的影响;大鼠皮下移植冻干牙,HE观察炎症反应情况。结果:冻干牙片表面玷污层较少,牙本质小管的开放程度较高,冻干牙整体形态与正常牙齿无差异;冻干牙釉质及牙本质的显微硬度都比正常牙略低但无统计学差别;冻干牙表面细胞的黏附生长情况要更好,在培养18h时细胞数量有显著统计学差异,MTT结果显示冻干牙对SHED细胞增殖活性的影响低于与正常牙;对移植后的大鼠皮肤进行HE染色,发现相同时间段正常牙植入组及冻干牙植入组的皮下炎症细胞的浸润程度没有显著差异,植入28天时炎症反应完全消退,未发现严重的免疫排斥反应。结论:制备的冻干牙不仅保持原有的形态结构和机械性能,并且具有良好的生物相容性和低免疫原性,是一种理想的牙再生支架材料。第二部分冻干牙复合SHED细胞聚合体异位移植的动物实验研究目的:观察SHED细胞聚合体复合冻干牙裸鼠皮下移植后牙髓、牙周、牙体组织再生情况,探索全牙再生的新方法。方法:分别将SHED细胞聚合体植入预备好的正常及冻干牙根管内,并且包裹覆盖牙根表面,而后移植至6周雌性裸鼠的背部皮下孵育。术后2月取材,组织脱矿后应用HE、免疫组化等方法观察分析组织再生情况。结果:组织学观察发现冻干牙组与正常牙组的再生组织充满根管,牙根表面也可见纤维结缔组织附着。HE染色显示两组根管内壁牙本质有新形成的前期牙本质,成牙本质样细胞排列整齐,其内侧可见均匀分布的成纤维样细胞、胶原纤维以及毛细血管结构;牙根表面可见牙周膜样的纤维结缔组织附着;再生组织中未见炎性肉芽组织及不规则钙化团块。免疫组化染色显示根管内再生组织中可见神经标志物S100染色阳性的纤维网状结构,并可见血管内皮细胞标记物CD31染色呈阳性。冻干牙组与正常牙组未见明显差异。结论:SHED细胞聚合体复合冻干牙异位移植后能形成包含成牙本质细胞、毛细血管及神经丛结构的牙髓组织以及牙周膜样组织。第三部分冻干牙复合乳牙牙髓干细胞聚合体用于小型猪牙髓牙周再生的实验目的:利用小型猪(mini-pig)牙再植实验模型检测自体牙及异体冻干牙复合自体乳牙牙髓干细胞(SPED)聚合体进行牙髓牙周再生的效果。方法:分离和培养小型猪的乳牙牙髓干细胞,制备SPED细胞聚合体;建立冻干牙再植的实验动物模型,设自体牙复合自体SPED聚合体再植组、异体冻干牙复合自体SPED聚合体再植组;术后6月对实验牙的动度、颜色进行观察,采集小型猪的外周血进行T细胞表面抗原的流式检测,取材后进行HE、免疫组化等组织学检测观察牙髓再生及牙周愈合情况。结果:进行异体冻干牙再植的小型猪未出现任何不良的免疫排斥反应,流式细胞检测发现异体冻干牙植入组小型猪外周血中CD3、CD4、CD8阳性表达的T细胞亚群比率与正常猪的无显著差异。再植的的异体冻干牙的颜色形态与正常猪恒牙无差别,牙冠切端均有不同程度的磨耗但未发现异常松动度。MircoCT显示复合SHED聚合体再植的自体及异体冻干牙均无任何根尖周及根管内异常病理学改变,牙周膜腔间隙明显,固有牙槽骨壁连续完整,牙周愈合情况良好。HE染色发现再植组根管内均可见类牙髓结构的再生组织,与正常牙对照类似;牙根表面未见明显炎性或替代性吸收,再生牙周组织结构与与正常牙未见差异。自体牙与异体冻干牙组间未见显著差异。结论:冻干牙具有低免疫原性,再植后不会引起宿主的免疫排斥反应,此外SPED聚合体复合冻干牙能再生重建正常形态结构的牙髓组织再生以及实现良好的牙周组织愈合。第四部分冻干牙复合SHED细胞聚合体用于完全脱位年轻恒牙延迟再植的初期临床试验目的:探索将完全脱位牙齿进行冻干后复合自体SHED细胞聚合体用于延期再植治疗的可行性,为后期开展全牙再生临床转化应用提供实验依据。方法:按照纳入标准收集牙齿完全脱位时间大于3小时的患者,知情同意后将离体牙进行冻干处理,同时采集患者的乳牙牙髓进行干细胞分离和培养;将冻干牙复合SHED聚合体再植于牙槽窝内,固定1个月后拆除固定装置;术后1年定期复诊,观察口内情况,进行X线检查、牙髓活力测试、多普勒血流分析,牙周检查,血清免疫学和淋巴细胞分析等。对照组进行常规延期再植治疗,将再植牙的根管及牙根表面进行清理后,Vitapex根管倒充填后再植入牙槽窝并固定。结果:三个月后临床检查发现实验组再植冻干牙的牙冠色泽正常,无松动;六个月后牙髓活力测试和多普勒血流分析结果显示阳性,牙周探诊龈沟深度正常;牙再植术后7天及6个月对患者进行的血清免疫学和淋巴细胞分析未发现异常;整个观察期内放射学检查显示牙根未见内外吸收以及根尖周炎症等异常病理表现,根管壁稍有增厚且牙周膜腔结构完整连续。而对照组在再植半年后逐渐出现根骨粘连表现,放射学检查显示弥漫性牙根炎性和替代性吸收。结论:自体SHED聚合体复合冻干牙用于完全脱位牙延迟再植治疗可以达到良好的治疗效果,恢复患牙的形态及功能。