线粒体是细胞中的能量工厂,也是细胞中多种代谢过程的中心。因此人类健康与线粒体的稳态及其正常功能的维持密不可分。本论文的研究围绕线粒体,构建了线粒体与内质网接触位点的报告子,还研究了线粒体内一个参与脯氨酸和鸟氨酸前体吡咯啉-5-羧酸(P5C)合成的酶P5CS调控线粒体内多种代谢途径的分子机制。线粒体与内质网接触位点(MERCs)是线粒体与内质网之间进行钙离子及磷脂交换的位置,也是细胞多种信号通路交互的平台。但目前对MERCs的组成、分布和动态变化了解还十分有限。研究最大的困难是缺乏简单实用的指示MERCs的标记物。本论文第一部分的研究构建了一个全新的能指示MERCs的工具,并利用这个工具分析了在不同刺激下细胞内MERCs的动态变化。这一工具基于Split GFP的Split GFP1-10和Split GFP11距离接近时会相互作用折叠成可以发出绿色荧光的GFP的机理。我们将编码Split GFP1-10和Split GFP11的DNA序列分别与编码内质网和线粒体定位信号的DNA序列连接起来,并在Split GFP11与线粒体定位序列间加入不同长度的连接子,构建表达质粒。进而在细胞中同时过表达以上两个质粒,在内质网和线粒体接触位点,线粒体上的Split GFP11与内质网上的Split GFP1-10可以结合发出绿色荧光,指示MERCs。利用这一MERCs报告子,我们观察并分析了在整个细胞周期过程中,在饥饿、内质网胁迫等细胞应激刺激下MERCs的分布和动态变化。通过活细胞观察,我们发现了MERCs会在短短数分钟内消失和重建。线粒体状态的变化会影响细胞内MERCs的数量,解偶联剂CCCP和呼吸链毒性试剂寡霉素A刺激细胞会增加其MERCs的量。而诱导内质网胁迫则对对MERCs无明显影响。我们还发现诱导细胞凋亡或是自噬也能增加细胞内MERCs的量,但用油酸处理细胞驱动细胞脂合成并不改变胞内MERCs的量。这一研究为研究MERCs提供了一个非常好的工具。本论文第二部分的研究关注线粒体内参与P5C合成的酶:吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)。编码这一蛋白的基因的突变在人类中导致多种疾病,但致病机理不清。本论文研究发现P5CS在线粒体内呈现棒状或环状分布。当细胞处于饥饿状态或被氧化试剂处理时,P5CS会转变为在线粒体内弥散分布。一些与人类疾病有关的P5CS突变形式也会在线粒体内弥散分布。本研究还发现P5CS的多聚化而不是催化活性是保障其特殊定位模式所必需的。本研究构建了P5CS敲除细胞,发现P5CS缺失时细胞的增殖速率降低,并且对应激刺激更加敏感。P5CS敲除果蝇孵化率降低、正常孵化的果蝇随着日龄增长出现感光神经元数目减少等退行性变化。类靶向代谢组研究表明,P5CS缺失时细胞会有明显的嘌呤代谢和脂代谢异常。P5CS缺失细胞积累了大量嘌呤体和脂滴。脂肪酸转运蛋白CPT1A以及一些β-氧化相关基因的表达水平下降。进一步研究发现,P5CS缺失细胞中出现线粒体呼吸链复合物的组装异常,细胞呼吸链缺陷可能导致了嘌呤合成和脂质消耗的障碍。本部分的研究将氨基酸合成、线粒体呼吸及其他关键代谢过程联系起来,这些细胞内代谢途径的失衡可能解释了与P5CS相关疾病的病理表现。