【摘 要】
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蛋白质和多糖作为食品中关键的两类生物大分子物质,可以影响食品的品质和性能,广泛存在于食品加工的各个领域。糖基化是蛋白质普遍存在的翻译后修饰之一,蛋白质经糖基化修饰后能够有效地改善蛋白质的功能及性质。N-聚糖酶（NGLY1）是一种去糖基化酶,在内质网相关降解过程中发挥至关重要的作用。由NGLY1基因突变引起的先天性去糖基化障碍是一种常染色体隐性遗传疾病,患者往往表现出生长发育迟缓、智力及运动障碍等症
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蛋白质和多糖作为食品中关键的两类生物大分子物质,可以影响食品的品质和性能,广泛存在于食品加工的各个领域。糖基化是蛋白质普遍存在的翻译后修饰之一,蛋白质经糖基化修饰后能够有效地改善蛋白质的功能及性质。N-聚糖酶（NGLY1）是一种去糖基化酶,在内质网相关降解过程中发挥至关重要的作用。由NGLY1基因突变引起的先天性去糖基化障碍是一种常染色体隐性遗传疾病,患者往往表现出生长发育迟缓、智力及运动障碍等症状。本研究以先天性去糖基化障碍患者血液样本为材料,通过全外显子组测序和Sanger测序技术对先证者血液DNA进行测序分析,鉴定患者的致病基因突变。构建NGLY1野生型和突变型真核表达载体,转染至细胞,通过细胞免疫荧光实验观察突变蛋白在细胞中的定位;构建NGLY1原核表达载体p GEX-6P-1-NGLY1和pET-28a-NGLY1,转化至E.coli BL21（DE3）和E.coli Arctic Express RIL感受态细胞中,经IPTG诱导,利用考马斯亮蓝染色的方法检测重组蛋白的表达;以斑马鱼为模式动物,构建ngly1敲低及过表达的斑马鱼突变体,并分析突变体的表型以及ngly1的缺失对斑马鱼胚胎发育的影响。结果表明,从三个先天性去糖基化障碍患者家系中鉴定出五个NGLY1基因突变位点,即c.698T>G（p.L233R）、c.1025A>G（p.Y342C）、c.1064G>A（p.C355Y）、c.1231C>T（p.R411X）和c.1405C>T（p.R469X）,其中3个位点为新发突变,即c.698T>G（p.L233R）、c.1064G>A（p.C355Y）和c.1405C>T（p.R469X）。在细胞免疫荧光实验中,与WT相比,NGLY1突变体蛋白的定位没有发生改变,但在细胞质中发生聚集,呈不均匀状态分布。利用原核重组方式构建并表达全长NGLY1,通过IPTG诱导,获得了可溶性的GST-NGLY1重组融合蛋白,为下一步进行NGLY1的大量表达及纯化奠定了基础。采用基因敲低及显微注射技术建立ngly1敲低和过表达的斑马鱼突变体,表型分析结果表明ngly1的缺失导致斑马鱼胚胎发育迟缓,并伴随不同程度的身体畸形,且死亡率显著升高,而这些表型在同时注射ngly1 m RNA后得到恢复,表明ngly1在斑马鱼胚胎发育中起着重要作用。综上所述,本研究以N-聚糖酶为研究对象,先天性去糖基化障碍患者血液为研究材料,利用分子生物学、生物化学及细胞生物学等手段来初步探究人类和斑马鱼N-聚糖酶的功能,这将为深入研究NGLY1基因的功能打下良好的基础,也为以斑马鱼为模式动物开展相关疾病的研究提供科学信息。
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