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目的:脑缺血再灌注神经元损伤与自由基密切相关,它们可能对信号蛋白进行共价修饰,其中NO对蛋白质巯基亚硝基化/去亚硝基化的修饰,是目前研究的热点。据报道TRX调节蛋白质的去亚硝基化,且TRX的氧化还原调控和抗凋亡功能主要依赖其69位半胱氨酸的S-亚硝基化。本文主要研究,在脑缺血/再灌注过程中,TRX去亚硝基化可能的分子机制及其作用。
方法:采用大鼠四动脉结扎法构建全脑缺血模型。分别给予Sprague-Dawley大鼠腹腔注射NMDA受体拮抗剂MK801(3mg/kg)、NO供体SNP(5mg/kg),脑室注射AMPA受体拮抗剂GYK152466(10uM)、含有GluR6亚基的KA受体拮抗剂NS102(10mM)、NO供体GSNO(5μg/只)、TrxR抑制剂Auranofin(10mM)、Fasl反义寡核苷酸(10nmol/10μl注射三次)、Fasl错义寡核苷酸(10nmol/10μl注射三次)。主要运用SDS-PAGE、免疫印记、免疫沉淀、和免疫组织化学方法对蛋白质之间的相互作用进行研究;应用焦油紫染色等方法检测脑缺血/再灌注诱导的海马神经元的存活和凋亡;蛋白质的S-亚硝基化的检测主要是通过‘生物素转化法’( Biotin-Swich method)。观察TRX在脑缺血/再灌注后的亚硝基化改变。
结果:
1静息条件下海马CA1区TRX具有一定的翻译后亚硝基化修饰水平。脑缺血/再灌注6h后TRX亚硝基化水平降低,即发生了去亚硝基化。
2给予NS102、GYKI、MK801、Auranofin、Fasl反义寡核苷酸均能够抑制脑缺血/再灌注诱导的TRX的去亚硝基化,说明了TRX的去亚硝基化与离子型谷氨酸受体,FasL-Fas系统和及其自身的TrxR有关。
3.外源性NO供体GSNO和SNP能够抑制TRX的去亚硝基化。
4.免疫组化的结果进一步揭示了TRX去亚硝基化所涉及的相关机制。
5.焦油紫染色的结果表明给予抑制TRX去亚硝基的药物具有抗脑缺血诱导的海马神经元迟发性死亡作用。
6.TUNEL凋亡检测的结果进一步证实了焦油紫染色的结果,表明通过抑制TRX去亚硝基化可以抗脑缺血诱导的海马神经元凋亡。
7.在缺糖缺氧诱导的SH-SY5Y(入神经细胞瘤细胞)细胞水平上进一步证明FasL和TrxR系统参与了TRX的去亚硝基化。
结论:脑缺血/再灌注引起TRX去亚硝基化,其去亚硝基化的机制与离子型谷氨酸受体及其自身的TrxR有关。而一些药物如GSNO、SNP、NS102、GYKI、MK801、Auranofin、Fasl反义寡核苷酸均能够抑制脑缺血/再灌注诱导的TRX的去亚硝基化,并且保护了神经元。