背景与目的乳腺癌（Breast cancer,Bca）是女性最常见的恶性肿瘤,也是世界上最常见的三大癌症之一。基于激素受体的表达情况不同,乳腺癌分为孕激素受体（PR）阳性、雌激素受体（ER）阳性、人类表皮生长因子受体（HER2）阳性及三阴性乳腺癌,其中有70%的乳腺癌被归为雌激素受体α（Estrogen Receptorα,ERα）阳性。而ERα也为治疗乳腺癌的最有效靶点之一,与乳腺癌的预后有关。而目前对于乳腺癌靶向ERα的内分泌疗法,部分患者出现了不可避免的耐药。所以,寻找一种新的化合物靶向ERα来治疗乳腺癌迫在眉睫。罗通定（Rotundine,又称左旋四氢巴马汀L-Tetrahydropalmatine,L-THP）是从千金藤属和紫堇属植物中分离得到的一种天然四氢原小檗碱异喹啉生物碱。临床上,罗通定作为传统中药治疗心血管疾病和多种疼痛已有40多年的历史,但其对于ER阳性乳腺癌细胞株的作用尚未见报道。我们研究发现罗通定通过诱导细胞周期阻滞而非促进细胞凋亡抑制ERα阳性乳腺癌细胞增殖;此外,罗通定可增强ERα阳性乳腺癌细胞对他莫西芬和氟维司群的敏感性。更有意义的是,罗通定可促进ERα的泛素化降解,过表达ERα可以补救罗通定介导的乳腺癌细胞生长抑制。总的来说,我们的研究表明,罗通定通过促进ERα的降解抑制乳腺癌细胞生长,为治疗ERα阳性乳腺癌提供了一种潜在的治疗方案。实验方法1.细胞活力测定:根据实验设计,用MTS试剂进行细胞活力测定。2.克隆形成实验:根据实验设计对细胞进行分组处理后,将细胞培养于六孔板中约两周（直到形成集落）,继而固定并用结晶紫对集落进行染色,用数码相机对每个处理组进行拍照并计数。3.Ed U细胞增殖实验:根据Ed U细胞增殖检测试剂盒说明书,对处理后的细胞进行染色,用荧光显微镜拍照并记录Ed U阳性细胞数/总细胞数的百分比。4.流式细胞检测术:（1）细胞周期检测:根据实验设计对细胞进行处理后,用70%乙醇固定细胞,次日,用细胞周期检测试剂盒对细胞进行染色后,流式细胞仪分析各时期细胞;（2）细胞凋亡检测,根据实验设计对细胞处理后,用Annexin V-FITC和PI对细胞进行染色,用流式细胞仪对各时期凋亡细胞进行分析。5.免疫印迹实验:根据实验设计对细胞进行处理后,收集各组细胞蛋白裂解产物,用免疫印迹实验对目的蛋白的表达进行分析。6.免疫荧光实验:根据实验设计处理细胞后,通过免疫荧光实验,用荧光显微镜观察各组目标蛋白的荧光强度及细胞中的定位。7.双荧光素酶报告基因检测实验:将带有目的报告基因的质粒转入细胞,根据实验设计处理细胞后,依照双荧光素酶试剂盒说明书,用酶标仪检测目标基因的转录活性。8.分子对接模拟实验:用Autodock软件对罗通定和目标分子ERα进行对接,分析两者的对接情况。9.实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-q PCR）:根据实验设计处理细胞后,用RNAiso plus提取RNA,经过逆转录获得c DNA,然后使用SYBR Green Dye进行定量PCR,通过获得扩增产物对靶基因的表达进行分析实验结果1.罗通定抑制ERα阳性乳腺癌细胞的生长用罗通定处理ERα阳性乳腺癌细胞T47D、MCF-7,24、48、72H,用MTS检测细胞活力,发现罗通定显著抑制ERα阳性乳腺癌细胞系的生长且呈浓度依赖和时间依赖;此外,克隆形成实验的结果表明罗通定对ERα阳性乳腺癌细胞的生长具有长期增殖抑制效应。Ed U染色实验的结果同样支持此观点。2.罗通定通过对ERα阳性乳腺癌细胞的细胞周期阻滞实现抗增殖效应用流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡,发现经罗通定处理后,在G0/G1期的细胞数增多,证实罗通定阻滞ERα阳性乳腺癌细胞从G1期向S期转变,此外,用免疫印迹法检测周期相关蛋白的表达:周期抑制蛋白p27表达上调,促周期蛋白CDK4、Cyclin D1、Rb、p-Rb表达下调;用流式细胞术检测细胞凋亡结果显示,经罗通定处理后,MCF-7细胞无明显凋亡细胞出现,说明罗通定对ERα阳性乳腺癌细胞的抗增殖效应不是通过细胞促凋亡作用。免疫印迹法检测凋亡相关蛋白PARP、Bcl-2的结果同样支持此观点。3.罗通定介导ERα蛋白表达的下调免疫印迹实验显示,经罗通定处理后,ERα蛋白的表达在MCF-7和T47D细胞中下调,此外,由于ERα为核转录因子,雌激素（E2）可以与ERα结合,激活其转录活性,促进其降解,当加入E2后,罗通定诱导ERα蛋白的表达下降更明显。免疫荧光实验的结果表明,罗通定可显著降低ERα的丰度,但是并未发生ERα的核转位。4.罗通定通过促进ERα的降解下调其表达RT-q PCR检测结果表明,ERαmRNA水平的表达未受影响;罗通定虽然不会诱导ERαmRNA水平发生显著变化,但其下游基因PS2,Cyclin D1受到罗通定的调控;此外,双荧光素酶报告基因的结果显示,罗通定可显著抑制ERα的转录活性。用CHX（环乙酰亚胺）抑制蛋白合成,在CHX的处理下,罗通定加速ERα蛋白的降解,进一步,CO-IP的结果显示,罗通定增加了ERα的泛素化和K48多聚泛素链水平,证实罗通定通过泛素蛋白酶体途径降解ERα。5.罗通定与ERα直接相互作用分子对接模拟实验结果表明,罗通定可直接靶向ERα。6.ERα过表达可减弱罗通定介导的部分生长抑制将人ERα的质粒转入T47D和MCF-7细胞中,发现过表达ERα可减弱罗通定诱导的细胞周期阻滞;此外,用免疫印迹评估促细胞周蛋白Rb和P-Rb的表达,结果显示,ERα过表达逆转了部分罗通定诱导Rb及P-Rb表达的下调。7.罗通定增强乳腺癌细胞对他莫昔芬的敏感性MTS结果显示,罗通定与他莫昔芬联合使用可增强其抗增殖效应,克隆形成实验也同样证实了此观点;免疫印迹实验检测ERα及其相关靶蛋白Cyclin D1的结果表明,与单一处理相比,二者联合处理组中两种蛋白表达下调更明显。此外,用流式细胞术检测细胞凋亡时,当罗通定与他莫昔芬联合使用时,细胞凋亡增多。免疫印迹实验检测Bcl-2、PARP的结果同样支持此观点。8.罗通定与氟维司群协同抑制乳腺癌细胞的生长MTS检测当罗通定与氟维司群联合使用时对细胞活力的影响,实验结果表明,罗通定增强了氟维司群在ERα阳性乳腺癌细胞中的抗增殖能力;克隆形成实验及Ed U增殖实验同样证实此观点。此外,免疫印迹实验结果显示,当罗通定与氟维司群联合使用时,ERα与其靶蛋白Cyclin D1的表达比二者单一使用时降低更明显。结论罗通定通过靶向ERα的泛素化降解抑制ERα阳性乳腺癌细胞的生长