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目的:微小RNA(micro RNA,mi RNA)已经被发现在不同类型的癌症细胞中呈高表达状态。有研究发现mi R-32是前列腺癌(Prostate cancer,PCa)的一个重要致癌基因,它可以促使前列腺癌细胞发生自噬导致前列腺癌细胞出现放疗抗性,但是mi R-32引起前列腺癌细胞产生放疗抵抗的作用机制目前基本上是未知的。DOC-2/DAB2交互式蛋白(DAB2IP)在抑制前列腺癌的抗辐射方面起着重要的作用,其作用机制主要是通过抑制细胞自噬来提高癌细胞的放射敏感性。两种基因在前列腺癌的放射治疗中的相关性未见文献报道,本文将研究前列腺癌在放射治疗期间mi R-32对癌细胞的存活和凋亡的调节机制及mi R-32与DAB2IP在前列腺癌中是否存在靶向关系,若mi R-32与DAB2IP存在靶向关系,则进一步研究mi R-32与DAB2IP靶向结合后对前列腺癌放疗敏感性的调控机制。方法:第一部分:内源检测1、分别选取前列腺癌组织4例、癌旁对照组织2例、良性前列腺增生组织2例,QPCR检测其中mi R-32水平;2、分别使用前列腺癌细胞系PC3、DU145及人正常前列腺上皮细胞RWPE-1,QPCR检测其中mi R-32水平;3、使用0、2、4、6Gy IR处理PC3、DU145细胞,QPCR检测其中mi R-32水平,为后续实验选取合适的IR剂量;4、双荧光素酶报告基因检测前列腺癌细胞中DAB2IP与mi R-32直接靶向关系。第二部分:功能建模1、分别合成pre-mi R-32和anti-mi R-32,分别转染DU145和PC3的细胞;2、QPCR检测转染后mi R-32和DAB2IP m RNA表达情况变化;3、WB检测功能模型中DAB2IP表达水平变化;分组:Con、pre-con、pre-mi R-32、anti-con、anti-mi R-32第三部分:功能实验1、The SF analysis实验检测放疗敏感性变化,使用IR处理PC3、DU145功能模型细胞分组:Con、pre-con、pre-mi R-32、anti-con、anti-mi R-32IR浓度:0、2、4、6Gy2、IR诱发的自噬检测,用2Gy IR处理细胞,处理后24h WB检测LC3B I/II、Beclin 1蛋白表达水平的变化以反映细胞自噬能力的改变;分组:Con、pre-con、pre-mi R-32、anti-con、anti-mi R-323、IR诱发的流式凋亡检测,用2Gy IR处理细胞后,流式检测细胞凋亡;分组1:Con、pre-con、pre-mi R-32、anti-con、anti-mi R-32分组2:con、pre-con、pre-mi R-32、pre-con+BFA(4n M)、pre-mi R-32+BFA(4n M);4、利用Talen敲除前列腺癌细胞中的DAB2IP,建稳株;5、用2Gy IR处理PC3-DAB(-)和DU145-DAB(-)细胞,处理后24h,WB检测自噬相关因子LC3B I/II、Beclin 1分组:con、pre-con、pre-mi R-32、anti-con、anti-mi R-326、IR诱发的流式凋亡检测,用2Gy IR处理细胞后,流式检测细胞凋亡;分组:con、pre-con、pre-mi R-32、pre-con+BFA(4n M)、pre-mi R-32+BFA(4n M)第四部分:信号通路研究:1、WB检测常规前列腺癌细胞中DAB2IP、pm TOR、m TOR、p S6K、LC3B和Beclin 1表达水平变化分组:Con、pre-con、pre-mi R-32、anti-con、anti-mi R-32结果:通过本研究发现mi R-32在前列腺癌细胞中可通过诱导前列腺癌细胞发生自噬及抑制放疗所诱导的前列腺癌细胞的凋亡来对抗放射线的损害。同时也发现DAB2IP是一种mi R-32依赖性的肿瘤抑制基因,mi R-32在前列腺癌细胞中通过与DAB2IP 3’非编码区域内的直接结合位点结合而呈上调或过度表达状态,同时抑制DAB2IP在前列腺癌细胞中的表达。在前列腺癌细胞中加入mi R-32 mimics模拟物,可观察到前列腺癌细胞在IR作用下的存活率明显增强,这可能是由于mi R-32可以逆转IR对前列腺癌细胞的损伤,致使前列腺癌细胞对放疗射线的敏感性下降。通过流式细胞分析发现,当前列腺癌细胞中mi R-32过表达和DAB2IP被敲除后,经过IR诱导的前列腺癌细胞的凋亡明显受到了抑制,但在上诉前列腺癌细胞株中加入4nm的BFA(Brefeldin A)(BFA为自噬抑制剂,可诱导细胞凋亡,在前列腺癌中靶向抑制细胞周期)后,前列腺癌细胞的凋亡率可恢复到正常水平。上面所诉的mi R-32过表达和DAB2IP被敲除后的前列腺癌细胞被IR处理后该细胞的自噬增强更为显著。同时也发现Mi R-32可以调控自噬相关蛋白的表达,如DAB2IP、自噬基因Beclin 1、LC3B I/II以及磷酸化S6K(p S6K)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)等。总之,这些研究数据可为mi R-32靶向DAB2IP对调节前列腺癌细胞的自噬诱导和抗辐射机制提供新的见解,可能会为前列腺癌的治疗做出新的贡献。结论:1、mi R-32与前列腺癌细胞放疗抗性的出现有关;2、mi R-32与DAB2IP在前列腺癌细胞中存在直接的靶向关系;3、mi R-32靶向DAB2IP对自噬的介导可能是通过m TOR-p S6K信号途径来实现的。