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人体胃肠道系统非常容易受到外来抗原、微生物和有害分子物质的侵害，产生过量的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)和自由基，引起细胞内氧化还原失衡，导致氧化应激的发生，从而造成生物大分子的氧化损伤，同时也导致产生过量的促炎细胞因子和激活免疫反应，进而造成肠道炎症。因此，针对氧化应激和炎症造成的肠道损伤，有效的应对方法包括通过抗氧化防御系统抑制氧化应激，或通过抗炎症防御系统减轻炎症，或两者兼而有之。我国每年产蛋量占世界40%以上，而蛋壳膜由大量的蛋白质组成，是非常丰富的蛋白质资源。但是，鸡蛋膜中存在无数的交联二硫键，从而导致鸡蛋膜不溶于水的特性，所以对鸡蛋膜的利用是有限的。目前世界上对鸡蛋膜蛋白酶解产物的制备方法较为单一，对其生物活性的研究少之又少，因此需要对来自鸡蛋膜生物活性多肽的制备及其生物活性开展进一步科学研究。首先建立碱性蛋白酶(Alcalase，AL)和蛋白酶(Protease S，PS)双酶酶解的方法，制得鸡蛋膜蛋白酶解物AL-PS及其超滤分离得到的组分AL-PS-I (分子量<5kDa)，AL-PS-II (5-10kDa)以及AL-PS-III (>10kDa)。通过化学抗氧化分析方法考察，发现AL-PS-I具有显著的还原力(1mg/mL，OD700nm0.308)、DPPH (IC500.6mg/mL)和OH·自由基(IC500.34mg/mL)清除能力，AL-PS-III具有良好的Fe2+螯合能力(IC501.8mg/mL)。通过细胞抗氧化活性分析方法研究，发现AL-PS-I可以在Caco-2细胞中有效清除细胞内自由基。通过建立过氧化氢(H2O2)诱导的氧化应激Caco-2细胞模型，发现AL-PS和AL-PS-I可以促进细胞内谷胱甘肽(Glutathione，GSH)的含量，减少促炎细胞因子Interleukin (IL)-8的分泌，抑制脂质和蛋白质的氧化。通过对细胞内源抗氧化酶的活力和抗氧化物的含量进行检测，结果表明，AL-PS和AL-PS-I可以上调γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-glutamylcysteine synthetase，γ-GCS)的活性及其mRNA表达，维持并促进细胞内GSH的合成，修复还原并提高GSH/GSSG的比值。AL-PS和AL-PS-I在正常细胞中可以提高谷胱甘肽还原酶(Glutathione reductase，GR)和谷胱甘肽S转移酶(Glutathione S transferase，GST)的酶活，在H2O2诱导的细胞模型中可以促进谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GPx)、GR和GST的活性。通过建立肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor，TNF)-或脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)诱导Caco-2细胞和HT-29细胞的炎症模型，发现AL-PS和AL-PS-I在TNF-诱导的两种细胞模型中，以及在LPS诱导的Caco-2细胞模型中能有效抑制IL-8的分泌(P<0.05)。而AL-PS-III在LPS诱导的HT-29细胞模型中显著抑制IL-8的分泌，抑制率能达到60%。通过荧光实时定量PCR研究发现，AL-PS和AL-PS-I在TNF-诱导的炎症细胞中下调促炎细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12和TNF-的表达，上调抗炎细胞因子IL-10的表达，在IL-10的辅助下有效减少炎症反应。AL-PS和AL-PS-III在LPS诱导的炎症细胞中抑制IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、TNF-和TLR4的表达，通过调控或影响TLR4受体，预防或减少炎症反应。通过蛋白免疫印迹检测发现(Western blot，WB)，AL-PS、AL-PS-I和AL-PS-III可以抑制NF-κB的激活，调控NF-κB信号通路。通过DSS诱导小鼠结肠炎模型，考察了AL-PS在体内的抗炎活性。结果表明，口服AL-PS (200mg/kg body weight，BW)可以有效缓解小鼠体重减轻和炎症临床症状。AL-PS抑制DSS诱导的小鼠体内TNF-和IL-6的分泌，且二者的蛋白水平和基因表达水平呈正相关(r=0.98，P <0.05；r=0.98，P <0.05)，尤其对IL-6分泌的抑制作用具有显著性(P <0.05)。AL-PS对体内炎症细胞因子有下调作用，尤其是对促炎细胞因子IL-6和抗炎细胞因子IL-10的作用显著(P <0.05)。此外，AL-PS可显著上调促细胞凋亡基因Bax基因的表达(P <0.05)，Bax/Bcl-2比值也有上升趋势。综上所述，鸡蛋膜蛋白酶解物具有良好的化学抗氧化性质以及在肠道细胞内的抗氧化应激性质，通过促进胞内抗氧化酶(GPx、GR和GST)的活力和抗氧化物(GSH)的还原或生成，抑制细胞内生物大分子(如脂质和蛋白质)的氧化，恢复细胞氧化还原的稳态。此外，鸡蛋膜蛋白酶解物在体外和体内都具有良好的抗炎活性。在肠道细胞模型中通过抑制NF-κB的激活，调节NF-κB信号通路下调促炎细胞因子和上调抗炎细胞因子，从而减少细胞中IL-8的分泌，起到抗炎作用。在DSS诱导小鼠结肠炎模型中通过调节IL-6相关的细胞信号通路，促进激活的T淋巴细胞的凋亡，帮助恢复体内肠道免疫平衡，在体内具有抗炎活性。因此，鸡蛋膜蛋白酶解物具有抗氧化应激和抗炎活性，可以有效保护肠道健康。该研究为探寻提高鸡蛋膜附加值的方法提供新的思路，同时为研发具有生物活性的可食性鸡蛋膜食品提供理论依据。