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背景与目的:脑转移与肺癌相关致死有着密切联系。在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的分类中,尤以肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)易发生脑转移,并且可以作为肺腺癌的独立预后因素。因此,深入了解非小细胞肺癌脑转移的机制,对于识别新的诊治靶点,以及改善肺癌患者预后至关重要。胰岛素样生长因子结合蛋白-3(Insulin-like growth factor binding protein-3,IGFBP3)是血液循环中,胰岛素样生长因子(Insulin growth factors,IGFs)最为重要的载体。研究发现,IGFBP3的异常表达与肿瘤的发生与演进相关,然而,IGFBP3在NSCLC脑转移中发挥的作用目前尚不清楚。因此,本研究旨在探讨IGFBP3在肺腺癌脑转移中发挥的作用及其潜在的机制。方法:分别收集在无血清培养基条件下,培养的人星型胶质细胞(HA1800)及人肺腺癌细胞(A549)的上清液,标记为:HA1800-CM、A549-CM,并用HA1800-CM模拟脑微环境。将A549细胞分别暴露于HA1800-CM,A549-CM。通过划痕实验,观察两实验组,在不同时间节点,划痕愈合能力的变化。利用基因芯片数据分析,筛选A549细胞分别暴露于HA1800-CM、A549-CM中显著上调的基因,将其选作为后续研究方向,并通过实时定量多聚酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)以及蛋白质免疫印迹法(Western blot)验证。通过上调该基因(IGFBP3)的慢病毒过表达载体转染A549细胞,构建IGFBP3过表达稳定细胞株。应用qRT-PCR及Western blot探讨过表达IGFBP3对上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影响。用转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)处理A549细胞,观察其形态改变,并通过qRT-PCR及Western blot探讨EMT标志物的变化。采用干扰si-RNA载体转染A549细胞,构建敲低IGFBP3的细胞株,再次用TGF-β1处理敲低IGFBP3的A549细胞,并应用qRT-PCR及Western blot探讨,暴露于TGF-β1后,敲低IGFBP3对EMT标志物的影响。通过transwell实验观察,过表达IGFBP3或敲低IGFBP3,对A549细胞迁移及侵袭能力的影响。接下来,通过qRT-PCR筛选IGFBP3变化时,母体抗生物皮肤生长因子同源物(Mothers against decapentaplegic homolog,Smads)家族中变化最为显著的基因。同时,在过表达IGFBP3的A549细胞中,敲低该基因探索该基因对IGFBP3所发挥效应的影响。最后,采用免疫组织化学观察,IGFBP3在63例人体肺组织及脑转移灶中的表达情况。实验分为5个组:a:正常肺组织组(15例);b:原发肺腺癌组织组(15例);c:出现其他转移的肺腺癌组织组(15例);d:出现脑转移的肺腺癌组织组(10例);e:肺腺癌脑转移灶组(8例)。结果:1.通过划痕实验发现,暴露于HA1800-CM的A549细胞(实验组)划痕愈合能力(即细胞迁移能力)明显高于暴露于A549-CM(对照组)的A549细胞。基因芯片筛查两实验组中A549细胞内基因的表达情况,结果表明,IGFBP3为上调最为显著的基因。据近年来学者的研究表明,IGFBP3在肿瘤发生发展中扮演着重要的角色,故我们选取IGFBP3作进一步研究。通过qRT-PCR及Western blot表明,暴露于HA1800-CM的A549细胞中IGFBP3在第4、5天的基因和蛋白水平的表达明显升高。2.当IGFBP3过表达时,A549细胞的EMT能力增强。用TGF-β1处理A549细胞后,细胞形态由鹅卵石状,过渡到细长的梭形形状。与形态变化一致的是,A549细胞经TGF-β1处理后,其EMT能力明显增强。同时,IGFBP3表达增高。敲低A549则显著降低了TGF-β1诱导的EMT。3.transwell实验结果提示:过表达IGFBP3,增强了A549细胞的迁移及侵袭能力。反之,敲低IGFBP3,A549细胞的迁移、侵袭能力明显降低。4.应用qRT-PCR观察IGFBP3过表达时,Smads家族的变化。结果提示,相比于对照组,IGFBP3过表达组中,Smad1,Smad4,Smad6及Smad7的表达增高。有研究表明,Smad4能够通过TGF-β,诱导的EMT促进乳腺癌患者出现骨转移事件。因此,我们选择Smad4作进一步研究。通过qRT-PCR和Western blot观察到,过表达IGFBP3的A549细胞中Smad4的表达增高。相反,敲低IGFBP3伴随着Smad4的下调。在用Smad4-siRNA(si-Smad4)感染A549细胞后,即使IGFBP3过表达,A549细胞的迁移和侵袭也被显著抑制。5.在免疫组织化学结果中,肺腺癌患者肺组织中IGFBP3表达较正常肺组织增高。同时,具有远处转移的肺腺癌患者,其肺组织与无转移的肺腺癌患者肺组织相比,具有更高的IGFBP3表达,尤其是具有脑转移的肺腺癌患者。在脑转移灶中也证实了IGFBP3的高表达。结论:(1)过表达IGFBP3,促进了A549细胞的EMT、迁移和侵袭能力。(2)IGFBP3在TGF-β/Smad4诱导的EMT中有重要作用。(3)在肺腺癌患者颅内转移灶及具有脑转移的肺腺癌组织中IGFBP3表达均明显升高。IGFBP3的上调可能介导肺腺癌的脑转移,使其成为肺腺癌脑转移潜在的诊治靶标。