视神经属于中枢神经系统,其损伤后常常缺乏有效的治疗手段,约50%的伤者最终失明。因此,研究视神经损伤后其神经元—视网膜神经节细胞的变化及影响其存活、轴突再生的因素,具有十分重要的意义。轴突损伤后视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells, RGCs)的存活和再生,是视觉科学基础与临床研究的热点和难点。视神经轴突损伤后由于轴浆流运输障碍引起多种神经营养因子的缺乏,导致RGCs的凋亡,同时,由于损伤所致视神经所处的微环境发生改变,髓鞘中抑制因子的释放,造成RGCs的再生困难。神经生长抑制因子的存在是哺乳动物视神经再生受限的重要原因。研究发现:中枢神经,包括视神经,其所处的微环境中存在三种主要的抑制因子,即:Nogo-66、MAG、OMgp。它们是通过一共同受体—NgR发挥抑制作用的。应用NgR的竞争性拮抗剂NEP1–40可阻断Nogo-66和NgR的结合,增强损伤后神经元的再生能力,但无法阻断其他的抑制因子;通过对成年SD大鼠行髓鞘蛋白主动免疫后,其RGCs在视神经钳夹伤后能显著再生,但髓鞘蛋白组成复杂,难以确定其中有效成分;针对NgR的单克隆抗体可部分中和掉髓鞘中抑制蛋白的作用,促进体外培养的神经元再生,但由于蛋白的半衰期效应,制约了其体内的进一步应用。因此,如果能有效的阻抑NgR在体内表达,从而为视神经再生提供理想的微环境,有可能促进视神经再生。RNA干扰(RNAi)技术是近年来出现的研究基因功能的一种方法,它通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA,导入细胞后发生一系列复杂的酶切反应,从而诱导内源性靶基因降解,达到阻止基因表达的目的,较基因敲除而言,它可以快速的研究基因功能。应用RNAi技术的一个重要挑战就是如何将小分子的RNA导入靶细胞或者高等动物活体内。对于体内RNAi实验而言,通过siRNA表达质粒或病毒载体在体内生成siRNA是很好的选择,二者比较,病毒载体可以直接高效率感染细胞,避免了质粒载体需要转染试剂辅助及转染效率低下而带来的种种不便,而且转染效果更加稳定。在病毒载体介导的基因转移途径中,高效的病毒载体的发展,是基因转移能付诸应用的重要环节,病毒载体虽然转导效率高,但还存在安全性和靶向性等问题,逆转录病毒具有潜在的致癌性,腺病毒具有较强的免疫原性,而在靶向性上,不同的病毒载体对不同组织细胞具有不同的亲嗜性,研究表明:rAAV-2对CNS神经元有着高度的亲嗜性,并可以有效的在RGCs中发挥RNAi作用。有研究发现刺破晶状体或者玻璃体腔注射Zymosan-A后,可诱导眼内产生一种无菌性炎症反应,导致玻璃体腔内巨噬细胞和其他炎性细胞的聚集,通过炎性细胞释放的某种或多种营养因子,可有效地提高RGCs的再生潜能,促进其再生。目前,通过病毒载体携带的RNA干扰基因治疗在视神经损伤后再生修复领域的应用,还处于探索阶段。视神经受损后,其所处的微环境中除了Nogo、MAG和OMgp外,尚存在其它多种抑制因子,而损伤一定时间后会出现胶质瘢痕,形成再生的物理屏障。因此,如何能有效的在胶质瘢痕形成前最大可能的抑制更多的抑制因子,同时提高RGCs自身的再生潜能,是治疗视神经损伤的努力方向。本研究目的—采用RNAi技术调控NgR基因的表达,减少或阻止神经生长抑制因子共受体—NgR的产生,同时联合应用Zymosan-A眼内注射,诱导眼内炎症反应,提高损伤视神经的再生潜力和修复效果,为治疗视神经损伤提供新的策略,同时也为中枢神经损伤修复研究提供借鉴和参考。本课题主要进行了以下4个方面的研究:1.筛选NgR靶向的siRNA序列,并于体外实验进行效应验证;2.构建NgR靶向的重组腺相关病毒siRNA表达载体,并于体内验证其RNA干扰效应;3.通过动物实验证实Zymosan-A眼内注射对RGCs的保护作用;4.通过动物实验了解NgR RNA干扰联合Zymosan-A眼内注射在视神经损伤修复中的作用。主要结果和结论如下:1.体外实验证实:NgR靶向的siRNA可成功下调海马神经元中NgR的表达,而对照序列对NgR的表达无影响,这为本研究中构建NgR靶向的siRNA重组腺相关病毒表达载体奠定了基础。2.构建了NgR靶向的siRNA重组腺相关病毒,并进行了扩增和纯化。PCR结果证实:目的基因已成功的导入重组腺相关病毒中;SDS-PAGE提示,rAAV纯度>98%,基因组滴度达到1012,细胞转染实验显示:EGFP活性表达正常。说明我们所需的重组腺相关病毒已成功包装,纯度和浓度均达到动物实验要求,这为本研究中动物实验提供了实验前提。3.体内转染实验显示:NgR靶向的siRNA重组腺相关病毒表达载体玻璃体腔注射4w后,视网膜神经节细胞层可见绿色荧光蛋白表达,8w时绿色荧光仍存在,提示重组腺相关病毒载体有效的转染了RGCs,同时也间接提示siRNA已于RGCs中成功表达。4.免疫印记实验显示:NgR靶向的siRNA重组腺相关病毒表达载体可有效的抑制大鼠RGCs中NgR蛋白的表达,而阴性对照序列的siRNA重组腺相关病毒表达载体和单一的腺相关病毒表达载体均对NgR的表达无明显影响,此种NgR抑制效应于病毒注射后4w即已存在,8w时仍持续,提示重组腺相关病毒已成功的整合到RGCs基因组中,从而可以发挥其长久RNA干扰作用。5.在体实验显示:视神经钳夹伤后,会导致RGCs广泛的凋亡。视神经钳夹伤21d时,PBS处理组和单纯钳夹伤组存活RGCs约为正常对照的2%,而Zymosan-A处理组中存活RGCs约为正常对照的20%,提示Zymosan-A诱导的眼内炎症反应对视神经钳夹伤大鼠的RGCs具有一定的保护效应。6.动物实验证实,单纯抑制NgR表达与Zymosan-A眼内注射均可一定程度地促进钳夹伤大鼠视神经轴突再生,两者联合应用显著促进了其修复效果。