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背景与目的血管的发生和形成是一基本的生物学过程,对健康和疾病均有至关重要的意义。新生血管形成(angiogenesis)在大约20种眼病中发挥着主要作用,其中角膜新生血管(corneal neovascularization, CRNV)在临床上的治疗仍是比较棘手的问题之一。目前关于角膜新生血管的发病机制尚未完全阐明,也无有效的治疗方法。碱烧伤诱导的角膜新生血管模型是一种敏感性强,重复性好,反应一致的炎症性模型,因其制作简单,便于观察等优点为研究炎症性角膜新生血管发生机制和治疗手段提供了理想的平台。CCR3是CC类趋化因子的受体-3,是一种非特异性受体,可与特异性的或者非特异性的受体结合并趋化嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、TH2淋巴细胞等炎症细胞向炎症部位募集,从而发挥促进炎症作用,这些细胞和分子均与过敏因素引起的炎症有关。最近有研究发现CCR3及其配体与脉络膜新生血管的发生发展有关,但CCR3及其配体在角膜新生血管中的具体作用和内在机制仍不明确。因此本课题从建立小鼠碱烧伤CRNV模型着手,利用RT-PCR方法检测CCR3mRNA在受损角膜组织中各个时间点上的表达,并观察CCR3小分子拮抗剂SB328437对碱烧伤后CRNV形成的影响,利用RT-PCR方法、免疫组织化学法从分子水平和细胞水平来探讨CCR3在碱烧伤诱导的CRNV形成过程中的作用与机制。为临床治疗角膜新生血管性疾病提供一些线索和一定的理论依据。材料与方法1、碱烧伤诱导建立CRNV模型的BALB/c小鼠30只,并于0d、2d、4d、7d、14d随机取角膜组织(每组6只),利用RT-PCR法检测CCR3mRNA在碱烧伤角膜组织中的表达情况。2、CRNV小鼠模型80只,并随机平均分为八组(每组10只)：125μg/ml CCR3拮抗剂干预组、250μg/ml CCR3拮抗剂干预组、500μg/ml CCR3拮抗剂干预组、0.2%透明质酸钠(Sodium hyaluronate, HA)对照组分别进行早期和晚期干预。自碱烧伤后立即或者碱烧伤一周开始局部滴眼干预,每日3次,每次3u1,持续1w或2w。并于碱烧伤后14d和21d裂隙灯显微镜下观察各组角膜新生血管形成情况,并拍照记录。同时处死所有小鼠,获取眼球分离角膜,以角膜铺片CD31荧光免疫组织化学法检测各组角膜新生血管发生情况,统计分析新生血管区域占整个角膜的面积比例,并比较两种干预方法各组之间差异,分析CCR3拮抗剂在早期和晚期干预对碱烧伤CRNV形成的影响。3、CRNV小鼠模型36只,随机分为500μg/ml CCR3拮抗剂干预组、0.2%HA对照组,每组18只小鼠。方法同早期干预,于碱烧伤后2d、4d、7d每组随机取6只小鼠处死,分离角膜组织,利用RT-PCR法检测并分析角膜组织中MCP-1、MCP-3mRNA表达的差异。4、CRNV小鼠模型28只,随机分为500μg/ml CCR3拮抗剂干预组、0.2%HA对照组,每组14只小鼠。方法同早期干预,于碱烧伤后2d、4d每组随机取7只小鼠取眼球,行冰冻切片,免疫组织化学法检测并比较各组角膜组织切片中巨噬细胞的浸润数量。结果1、CCR3mRNA在碱烧伤后0d、2d、4d、7d、14d的角膜组织呈动态表达,并且2d、4d、7d的表达明显高于0d,提示CCR3参与碱烧伤诱导角膜新生血管的发生发展。2、重复性实验结果显示：在早期干预组中,碱烧伤后14d,500μg/ml CCR3拮抗剂干预组CRNV形成较对照组明显减少(P<0.05),而125μg/ml和250μg/ml CCR3拮抗剂干预组与对照组之间比较,血管生成有下降的趋势,但差异没有统计学意义(P>0.05)。而在晚期干预组中,各干预组与对照组相比较,CRNV形成情况没有明显的差异(P>0.05),提示500μg/ml CCR3拮抗剂能在碱烧伤早期抑制角膜新生血管的形成。3、碱烧伤后2d、4d500μg/ml CCR3拮抗剂干预组小鼠角膜组织中MCP-1、 MCP-3mRNA的表达水平与对照组相比,均明显降低(P<0.05),而7d干预组MCP-1、MCP-3mRNA的表达水平与对照组相比,没有明显差异(P>0.05),提示500μg/ml CCR3拮抗剂可能在碱烧伤早期通过下调角膜组织中MCP-1、MCP-3mRNA的表达而抑制CRNV的形成。4、碱烧伤后2d、4d500μg/ml CCR3拮抗剂干预组小鼠角膜组织中巨噬细胞的浸润数量均较对照组低,其中4d两组间差异具有统计学意义(P<0.05),提示500μg/ml CCR3拮抗剂在碱烧伤早期可能通过减少巨噬细胞向角膜组织中浸润,而达到抑制CRNV形成的作用。结论1、CCR3参与碱烧伤诱导的角膜新生血管的发生发展过程,500μg/ml CCR3拮抗剂在碱烧伤早期干预能抑制CRNV形成。2、CCR3拮抗剂抑制碱烧伤诱导的CRNV,可能与其下调碱烧伤早期角膜组织中MCP-1、MCP-3mRNA的表达,同时降低巨噬细胞向角膜组织的浸润有关。3、局部应用CCR3拮抗剂干预,可能成为临床治疗CRNV一个新的途径。