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[研究目的]肺癌在世界范围内高居恶性肿瘤发病率及死亡率首位,而肺癌转移是患者死亡的主要原因,故研究肺癌的转移机制非常重要。肿瘤细胞上皮间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT）是肿瘤进展及转移的重要过程,而 TGF-β信号通路在多个肿瘤中有较强的EMT诱导作用,SMADs蛋白家族是TGF-β信号通路中将上游信号传导至下游的中介分子,其中SMAD2直接参与TGF-β信号通路的传导,但有关SMAD2在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）中的作用及调控机制的研究报道较少。微小RNA（miRNA）是一类非编码RNA,通过调节多个信号通路影响肿瘤细胞的增殖及侵袭。本课题组在既往对miRNA的研究中发现,microRNA-486-5p在NSCLC肿瘤组织中呈现显著低表达,进一步通过生物信息学软件预测发现microRNA-486-5p与SMAD2mRNA3’ UTR区存在明显的互补序列。两者在NSCLC的发生发展过程中是否发挥一定的作用及两者之间的关联如何,值得进一步探讨。本研究通过检测SMAD2在NSCLC组织和细胞株中的表达,分析其临床意义;通过干扰NSCLC细胞株SMAD2的表达,观察SMAD2对肿瘤细胞增殖及侵袭能力的影响,探讨其作用机制;同时,通过Targetscan软件及基因芯片筛选出microRNA-486-5p,探讨microRNA-486-5p对SMAD2的调控作用及相关机制。该研究为NSCLC的诊治提供了新的策略,为临床转化应用提供一定的理论基础和依据。[研究方法]1、通过实时荧光定量PCR方法检测65例NSCLC肿瘤组织及配对癌旁组织标本中的SMAD2 mRNA表达量,免疫组化方法检测肿瘤组织中SMAD2蛋白的表达,分析SMAD2表达与临床资料的相关性;生物信息学大数据分析SMAD2表达与NSCLC患者预后的关系;2、采用实时荧光定量PCR方法和Western Blot方法检测NSCLC细胞株的SMAD2 mRNA及蛋白的表达;构建干扰SMAD2的瞬转细胞株,并通过实时荧光定量PCR及Western Blot方法检测SMAD2表达;用CCK-8法检测经SMAD2干扰后NSCLC细胞数量增殖的差异,再用划痕及Transwell实验分别检测SMAD2干扰后及TGF-β1刺激后NSCLC细胞转移能力的变化;Western Blot方法检测肿瘤细胞EMT相关蛋白的变化;3、运用Targetscan软件筛选可能调控SMAD2的潜在microRNAs,最终筛选出microRNA-486-5p作为研究对象。构建含有预测靶向结合序列的双荧光素酶报告载体进行双荧光素酶实验;采用实时荧光定量PCR方法检测NSCLC细胞株中microRNA-486-5p的表达,同时,测定65例NSCLC肿瘤组织及配对癌旁组织标本中的microRNA-486-5p表达,分析其与临床资料的相关性;在NSCLC细胞中过表达或者沉默表达microRNA-486-5p后,采用实时荧光定量PCR和Western Blot方法检测SMAD2的表达;通过划痕实验及Transwell实验检测过表达或者沉默表达microRNA-486-5p对NSCLC细胞转移能力的影响,再用Western Blot方法检测EMT相关蛋白变化;采用Transwell实验检测microRNA-486-5p过表达及TGF-β1刺激对肿瘤细胞侵袭能力的影响,并用Western Blot方法检测转移相关蛋白的变化。[研究结果]1、SMAD2 mRNA在NSCLC肿瘤组织中的表达高于癌旁组织的表达,差异具有统计学意义（p＜0.05）;免疫组化结果显示SMAD2蛋白表达在肿瘤细胞的细胞浆及细胞核中;进一步分析发现SMAD2的表达与患者年龄、性别、病理类型、分化程度、吸烟等临床资料之间无显著相关性（p＞0.05）,但在淋巴结转移和较晚分期患者肿瘤组织中表达高于无淋巴结转移和较早分期患者,均具有统计学差异（p＜0.05）;生物信息学大数据分析发现SMAD2高表达与患者预后差相关（p＜0.05）;2、SMAD2在NSCLC细胞株A549和H226中高表达;经SMAD2干扰后,A549和H226细胞的增殖能力无改变,但细胞迁移和侵袭能力均减弱;Western Blot结果显示SMAD2干扰组肿瘤细胞EMT相关蛋白E-cadherin表达上调,p-SMAD2、N-cadherin、Vimentin、Snail和MMP-2表达下调;经TGF-β1刺激后,肿瘤细胞迁移侵袭能力增强,E-cadherin表达下调,N-cadherin、Vimentin、Snail和MMP-2表达上调;干扰SMAD2表达能够抑制TGF-β1诱导的肿瘤细胞迁移侵袭能力增强,并与抑制EMT相关蛋白的改变有关;3、双荧光素酶实验结果显示:microRNA-486-5p显著抑制野生型载体的荧光活性,但无法抑制突变型载体的荧光活性;microRNA-486-5p在NSCLC细胞株中低表达,在NSCLC组织中表达低于癌旁组织,差异具有统计学意义（p＜0.01）;进一步分析显示microRNA-486-5p的表达与患者的临床资料之间无明显相关性（p＞0.05）;A549和H226细胞株转染microRNA-486-5p mimics后SMAD2 mRNA及蛋白表达显著下调,证实microRNA-486-5p可以负向靶向调控SMAD2的表达;与对照组相比,过表达microRNA-486-5p后,肿瘤细胞的迁移和侵袭能力下降,E-cadherin蛋白表达上调,p-Smad2、N-cadherin、Vimentin、Snail和MMP-2蛋白表达下调;与对照组相比,沉默表达microRNA-486-5p后,肿瘤细胞SMAD2表达显著上调,肿瘤细胞的迁移和侵袭能力增强,E-cadherin 蛋白表达下调,p-Smad2、N-cadherin、Vimentin、Snail和MMP-2蛋白表达上调;microRNA-486-5p过表达抑制了 TGF-β1诱导的肿瘤细胞E-cadherin蛋白表达下调,同时抑制了 N-cadherin、Vimentin、Snail和MMP-2蛋白表达上调。[研究结论]1、SMAD2在NSCLC肿瘤组织中表达增高,且SMAD2高表达与患者的临床分期及淋巴结转移相关;2、SMAD2通过调控EMT相关蛋白促进NSCLC细胞的迁移及侵袭;3、MicroRNA-486-5p在NSCLC肿瘤组织中呈显著低表达,且与SMAD2mRNA 3’UTR区互补,并负向调控SMAD2,进而抑制了 TGF-β诱导的NSCLC侵袭和转移。