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癌症是我国各类疾患致死的主要原因之一。胆管癌(Cholangiocarcinoma,CCA)是肝癌中第二大流行的原发性恶性肿瘤。更为深入的了解CCA的生物学特性,对于开发更有效的治疗方法尤为重要。近年来,体外三维培养模型在肿瘤发病机制研究以及药物筛选研究方面进展迅速。作为一种新型研究模型,体外三维肿瘤模型可以在体外重现体内肿瘤微环境的复杂性,保持癌细胞异质性,使得肿瘤细胞在形态和信号传递方面更加接近于体内环境。构建体外三维肿瘤模型的关键在于选取合适的生物支架材料。水凝胶类生物材料因其具有与活组织类似的机械性能以及优良的生物相容性等特征,已广泛应用于体外三维模型建立、再生医学、药物筛选、药物递送等各个领域。作为一种应用较为成熟的水凝胶材料,Matrigel已广泛应用于三维肿瘤模型相关研究。在胆管癌分子靶向治疗方面,TKI抑制剂近年来受到广泛关注,如Sorafenib,Regorafenib等均已进入临床试验阶段,然而诸多用于胆管癌临床试验的TKI抑制剂均以失败告终。安罗替尼作为一种小分子多靶点酪氨酸激酶抑制剂,具有抗肿瘤血管生成和抑制肿瘤生长的作用,有望作为胆管癌治疗中潜在的靶向药物。目前,尚未见以基于Matrigel的胆管癌体外三维模型研究胆管癌细胞对安罗替尼药物反应性的报道。脱细胞技术的发展为体外三维肿瘤模型的建立提供了一个新的契机。研究人员通过不同的脱细胞方法可将组织或器官中所有细胞物质移除,在不影响结构完整性以及生物学活性的前提下获取脱细胞基质。脱细胞基质作为生物支架材料可以为周围细胞提供大分子的三维网络、结构和功能支持,在组织工程研究领域应用越来越普遍。脱细胞基质支架能够更加密切地模拟体内微环境,且与其他体外模型相比,肿瘤细胞在其来源组织或转移组织的脱细胞基质支架中具有更接近于在体组织的生物学特性,有望成为三维肿瘤模型建立的理想材料。目前,尚未见以肝脏脱细胞基质水凝胶建立胆管癌体外三维模型的相关报道。本论文主要从以下两个方面开展相关研究工作:第一部分:基于Matrigel的胆管癌体外三维模型的建立及其应用目的:建立基于Matrigel的胆管癌体外三维模型并以其为模型检测胆管癌细胞对安罗替尼的反应性。方法:将三种胆管癌细胞系QBC939、RBE、HCCC9810接种至Matrigel中培养5天建立了三种基于Matrigel的胆管癌体外三维模型;通过组织学检测、CellTiter-Blue细胞增殖检测以及荧光实时定量PCR等方法对胆管癌三维模型的组织形态、细胞增殖情况、血管化及转移侵袭相关基因表达以及对安罗替尼的反应性展开研究。结果:胆管癌细胞系在Matrigel中培养5天可形成70～120 μm直径的细胞聚集体:其中含有主要的细胞外基质蛋白与多糖,I型胶原及IV型胶原含量与III型胶原相比较高;Matrigel三维模型中QBC939的生长速率低于二维模型,而RBE和HCCC9810则高于二维模型;Matrigel三维模型中胆管癌细胞的血管化与MMP家族相关基因的mRNA表达模式与二维模型有明显差异。药物处理结果表明,安罗替尼均能够以剂量依赖的方式抑制Matrigel三维模型中胆管癌细胞的增殖,且与二维培养模型相比,Matrigel三维模型对安罗替尼的敏感性降低。结论:成功建立了基于Matrigel的胆管癌体外三维模型,该模型与二维模型在肿瘤细胞生长、血管化与侵袭相关基因表达及对安洛替尼反应性等方面存在差异。本部分研究可为安罗替尼用于胆管癌临床治疗的可行性提供实验支持,也为第二部分基于肝脏脱细胞基质水凝胶的胆管癌三维模型的建立和应用研究提供对比和参照。第二部分:基于肝脏脱细胞基质水凝胶的胆管癌体外三维模型的建立及其应用目的:制备肝脏脱细胞基质水凝胶并以其为支架构建基于肝脏脱细胞基质水凝胶的胆管癌体外三维模型,评价以其作为体外胆管癌生物学研究及药物筛选模型的可行性。方法:采用基于Triton X-100+SDS的化学洗脱法对大鼠肝脏进行全器官细胞洗脱处理,制备肝脏脱细胞基质水凝胶;将胆管癌细胞系QBC939、RBE、HCCC9810分别接种于肝脏脱细胞基质水凝胶中培养5天建立基于肝脏脱细胞基质水凝胶的胆管癌体外三维模型;以二维培养模型和Matrigel三维模型作为对照,研究基于肝脏脱细胞基质水凝胶的胆管癌三维模型的组织形态、细胞增殖情况、血管化及转移侵袭相关基因表达以及对安罗替尼的反应性,并对安罗替尼血管化抑制作用的相关信号通路展开研究。结果:大鼠肝脏经Triton X-100+SDS脱细胞化处理后可保留天然细胞外基质中的主要蛋白组分、多糖以及部分生长因子;脱细胞基质经胃蛋白酶消化处理可获得生物相容性良好的温度敏感性脱细胞基质水凝胶(DLM);胆管癌细胞系在DLM水凝胶中培养5天可形成50～100 μm直径的细胞聚集体;其中含有主要的细胞外基质蛋白与多糖,I型胶原蛋白呈强表达,III型与IV型胶原蛋白呈弱表达,表明基于DLM水凝胶的胆管癌三维模型与Matrigel三维模型具有不同的胶原蛋白的分布规律;DLM三维模型中胆管癌细胞的生长速率显著高于其在Matrigel三维模型中的生长速率;与二维模型及Matrigel三维模型相比,DLM三维模型中胆管癌细胞的血管化与MMP家族相关基因的mRNA表达明显升高,因而可能具有更强的血管化作用与侵袭能力;药物处理结果表明,与二维培养模型相比,两种三维模型中胆管癌细胞对安罗替尼的敏感性均降低,且DLM三维模型中的胆管细胞对安罗替尼的敏感性高于基于Matrigel三维模型;Western Blotting进一步证实,在DLM胆管癌三维模型中,安罗替尼能够抑制PDGF-BB和FGF-2诱导的ERK及Akt的磷酸化,进而发挥血管化抑制作用。结论:建立了基于肝脏脱细胞基质水凝胶的胆管癌体外三维模型,与Matrigel三维模型相比,胆管癌细胞在肝脏脱细胞基质模型中的生长、血管化与侵袭相关基因表达及对安洛替尼的药物反应性均显著提高。本研究不仅有望为胆管癌的研究提供一种新的基于肝脏脱细胞基质水凝胶的体外三维模型,也可为肿瘤三维模型建立中新型支架材料的设计与研发提供指导与依据。