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假单胞菌广泛存在于土壤、海洋等自然环境。虽然某些假单胞菌,会引起多种农作物如小麦、水稻、番茄等的病害,但大多数荧光性假单胞菌都可以作为植物根际促生菌,抑制植物病原菌,促进植物生长。研究发现假单胞菌可以产生多种抗生性次级代谢产物,其中环脂肽是一类理化性质稳定、分子中具有环状结构的脂肽类化合物。一方面环脂肽可以作为生物表面活性剂,另一方面其在抗真菌、细菌、病毒、线虫及抑肿瘤活性,还有免疫抑制等方面也有一定的作用。实验室前期筛选到一株Pseudomonas exrtremaustralis YL19(以下简称YL19),具有良好的抗生活性,通过质谱分析初步鉴定其可合成Viscosin家族环脂肽中Massetolide化合物的一系列同系物,但菌株本身环脂肽Viscosin合成量低,并且合成调控网络复杂。研究表明Gac/Rsm转录后调控系统调节多种环脂肽的合成,而Hfq蛋白作为全局调控因子可以调节多种脂肽类物质的合成。为了明确菌株YL19的Viscosin的合成调控机制,定向改造获得该化合物的高产菌株,本课题首先在基因组水平预测菌株YL19合成环脂肽的类型、合成途径、Gac/Rsm调控系统各核心因子以及Hfq蛋白的存在,然后通过对基因gacA、rsmA、rsmE的敲除和回补,将Hfq过表达,初步验证了 Gac/Rsm调控系统和全局调控因子Hfq对菌株YL19合成环脂肽的调控机制。(1)基因组水平预测菌株YL19环脂肽类型及其合成途径:通过anti-SMASH在线软件预测菌株YL19合成的次级代谢产物有11种,进一步分析其中的NRPS基因簇和NRPS-A结构域氨基酸序列聚类分析,确定菌株YL19合成的环脂肽是Viscosin家族。基于已鉴定的PKS_KR和NRPS编码基因,推导出Viscosin生物合成的途径。(2)基因组水平预测菌株YL19环脂肽的调控网络:通过NCBI-blast同源序列比对及菌株YL19的基因组信息,确定了 Gac/Rsm调控系统中GacS,GacA,RsmA和RsmE四个核心因子及全局调控因子Hfq的存在;从菌株YL19的基因组信息提取出17条sRNA预测出10条sRNA的转录可能受GacA蛋白调控,结合MFOLD(37℃折叠)程序中sRNA的二级结构、GGA基序及其所在位置的预测,进一步筛选出3条sRNA可能参与到Gac/Rsm调控系统中;通过RsmA/E结合靶向基因的保守基序5’-WCANGGANGW-3’,在菌株YL19基因组中搜索获得2个位于菌株YL19的环脂肽Viscosin合成基因簇的上下游的mRNA靶基因,通过系统发育树分析,进一步确定了其为Gac/Rsm系统调控的直接靶基因-LuxR类型转录调控因子。(3)GacA对菌株YL19环脂肽合成的调控作用:利用自杀载体pknock-Gm获得YL19-gacA基因突变株,利用表达载体pME6032获得YL19-gacA基因回补株。当gacA基因突变后RsmY表达量没有变化,而RsmZ表达量下调,RsmA、RsmE表达量均显著上调,LuxRU表达量没有变化而LuxRD显著上调,初步判断在菌株YL19中预测到GacA在Gac/Rsm调控系统中发挥作用,并且激活后通过sRNA RsmZ发挥调控作用。gacA基因突变后环脂肽产量减少,gacA基因回补后环脂肽产量有一定恢复,说明GacA在YL19环脂肽合成调控中是一个正调控因子。(4)阻遏蛋白RsmA、RsmE对菌株YL19环脂肽合成的调控作用:利用自杀载体pknock-Gm获得YL19-rsmA、YL19-rsmE基因突变株,利用表达载体pME6032获得YL19-rsmA、YL19-rsmE基因回补株。当rsmA、rsmE任一基因突变后另一个阻遏蛋白表达量均上调,说明RsmA、RsmE相互抑制,在Gac/Rsm系统中相互协调发挥调控作用。当rsmA基因突变后LuxRU、LuxRD表达量没有变化,rsmE基因突变后LuxRU表达量没有变化,而LuxRD表达量上调,进一步说明环脂肽基因簇两侧的LuxR型转录调控因子是LuxRD发挥调控作用。rsmA基因突变后RsmE表达量上调,环脂肽产量增加,而rsmE基因突变后RsmA表达量上调,环脂肽产量却降低,由此推测RsmA在菌株YL19环脂肽合成调控中是一个负调控因子,而RsmE通过抑制阻遏蛋白RsmA的表达而对菌株YL19环脂肽合成起到正调控的作用。(5)Hfq对菌株YL19环脂肽合成的调控作用:利用表达载体pME6032获得YL19-hfq基因过表达株。hfq基因过表达后RsmY表达量上调但RsmZ表达量下调,由此推测Hfq可以调控sRNA RsmY增加其稳定性。将hfq基因过表达后LuxRU表达量下调,LuxRD表达量上调明显。由此推测可能是Hfq通过LuxR型转录调控因子LuxRU、LuxRD来调控菌株YL19环脂肽的合成。hfq基因过表达后菌株YL19环脂肽合成量减少,推测hfq基因过表达后使菌株进入稳定期的时间推后,而稳定期是环脂肽收获的最佳时期,由此导致环脂肽积累量减少。