研究背景与目的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)是一类名为表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)家族的细胞外蛋白配体的细胞表面受体。表皮生长因子受体是ErbB受体家族的成员之一,ErbB家族是包含四种紧密联系蛋白的亚家族,这四种蛋白分别是受体酪氨酸激酶类：EGFR (ErbB-1)、 Her2/c-neu (ErbB-2)、Her 3 (ErbB-3)以及Her 4 (ErbB-4)。影响EGFR表达水平异常或活性的突变很有可能导致多种癌症。EGFR是一种跨膜蛋白,它的结构包括细胞膜外的配体结合区域、跨膜区域以及胞内区域。其可激活的磷酸化位点位于胞内部分,包括Y992、Y1068以及Y1173等。雌激素受体(estrogen receptor, ER)是主要由雌激素(17β雌二醇)激活的一种类雌激素受体。一旦被雌激素激活,ER能够被活化随之易位到细胞核中并与DNA结合以调节不同基因的活性一一它是一种主要功能位于核内的DNA结合转录因子。雌激素受体ER在半数以上的乳腺癌中表达,其蛋白水平的高表达是乳腺癌的致癌因素之一,同时ER也是比较传统而且重要的乳腺癌内分泌治疗指标,医学科学界针对ER的研究一直是乳腺癌治疗研究的热点之一,而且临床治疗方面已经拥有了针对ER的比较成熟的治疗药物如他莫昔芬(Tamoxifen,TAM)。在之前的研究中,本实验室已经发表一篇文章阐述了PTPH1对ER的调节作用。蛋白酪氨酸磷酸酶H1 (protein tyrosine phosphatase H1, PTPH1),从基因层面也被叫做酪氨酸蛋白磷酸酶非受体类型3 (tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 3, PTPN3),是由PTPN3基因编码并且表达的酶。PTPH1是蛋白质酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatases, PTPs)家族的一个成员,主要在细胞质中发挥功能。多种研究显示PTPs家族成员大多可调节多种细胞自身活动,包括细胞生长、分化、有丝分裂周期以及致癌性转化等。研究证实PTPH1在乳腺癌中有50%的表达率,对乳腺癌的临床诊疗工作有着重要的科研价值。酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor, TKI),是一类可以针对性地抑制酪氨酸激酶发挥正常作用的化合物。其主要生理作用是阻断ATP中的磷酸根结合酪氨酸残基,从而达到控制癌细胞增殖的作用。现今比较有效的TKI类药物如：拉帕替尼(Lapatinib, LAP)以及吉非替尼(Gefitinib, GEF),前者的主要治疗靶点是EGFR蛋白以及Her2蛋白,国际上主要用于乳腺癌晚期、乳腺转移癌以及联合治疗；后者的主要治疗靶位是EGFR。本课题组在早先研究中观察到：PTPH1会对雌激素受体ER的Y537位点去磷酸化,同时增加ER的核内转移活动,从而提升乳腺癌细胞对雌激素受体拮抗剂他莫昔芬的敏感性；此外,本实验室己发表文章中阐述了PTPH1可以对表皮生长因子受体EGFR的Y1173位点进行去磷酸化的可能。综合上述发现,我们考虑PTPH1蛋白水平变化意义重大：PTPH1对EGFR在Y1173位点的去磷酸化很可能具有潜在的调节TKI类抗肿瘤药物一一如拉帕替尼和吉非替尼敏感性的可能；而针对PTPH1可以同时调节EGFR与ER两种蛋白分子,我们设计实验探讨PTPH1对TKI类药物与ER拮抗剂联合用药效果的影响,并针对上述一系列设想建立了课题思路。研究方法为了检验上述假设,我们预先设计了三部分比较系统性的实验。在第一部分实验中,选用PTP H1过表达癌细胞、正常表达PTPH1的同细胞系癌细胞以及PTPH1敲低癌细胞株进行相关TKI抗癌药物(拉帕替尼Lapatinib,吉非替尼Gefitinib)敏感性实验,以检测PTPH1表达水平对所选择药物抗癌效果的影响。在第二部分实验中,对相关细胞系进行有条件的培养,随后用Western blot实验检测PTPH1是否可以调节相关抗癌药物的靶向蛋白EGFR蛋白水平、稳定性以及相关位点的磷酸化水平。最后第三部分研究计划,包涵了一系列综合实验,包括Western blot、免疫沉淀、核浆分离实验等对PTPH1调节EGFR的膜易位、ER的核内易位以及ER与EGFR的相互作用进行了研究分析,同时这部分实验可以综合性地探讨PTPH1是否能够分别调节EGFR蛋白水平和促进ER转移到细胞核内,从而增强相关靶向治疗药物(TKI类药物和他莫昔芬Tamoxifen)对乳腺癌细胞的联合抑制作用。上述实验构成了一整个体系,探讨PTPH1对TKI类药物(以及与他莫昔芬联合用药)的敏感性调节及其原理。结果1.PTPH1提升了乳腺癌细胞对TKI类药物的敏感性：PTPH1表达水平的提高特异性增强了MCF7、T47D以及MDA-MB-231 (231)细胞对TKI类药物(拉帕替尼和吉非替尼)的敏感性；而在同类细胞系当中,如果PTPH1蛋白被敲低会下调TKI类药物的效果——PTPH1水平降低之后细胞耐药性出现。PTPH1水平决定了癌细胞对TKI类药物的抵抗。2. PTPH1可以对EGF R在Y1173位点上进行去磷酸化。与PTPH1正常表达的对照组相比,PTPH1过表达细胞中Y1173位点的磷酸化水平明显降低,而且这种去磷酸化作用也存在于体外293T细胞中；反之PTPH1敲低的细胞系的Y1173磷酸化水平获得上调。PTP HI对Y1173位点的去磷酸化依赖其自身催化能力,失去催化能力的PTPH1突变体PTPH1/S459A和PTPH1/DA没有去磷酸化功能。3. PTPH1可以上调EGFR蛋白表达水平：Western Blot证实在PTPH1过表达细胞中,EGFR的水平明显高于PTPH1正常表达细胞；反之,癌细胞中的PTPH1敲低之后,EGFR水平随之下降。PTPH1失去磷酸化功能的突变体PTPH1/S459A无法上调EGFR蛋白。在体外293T细胞中,PTPH1上调EGFR蛋白的功能仍然存在。放线菌酮(Cycloheximide, CHX)实验证实PTPH1上调EGFR蛋白的原因主要为增强EGF R蛋白的稳定性；EGFR的突变体EGFR/Y1173F存在不依赖PTPH1的高稳定性；PTPH1的突变体PTPH1/S459A无法提高EGFR蛋白的稳定性。泛素实验证实PTPH1过表达导致泛素介导的EGFR蛋白降解减少；EGFR/Y1173F存在PTPH1非依赖性泛素化降解减少。相关细胞集落实验发现EGFR过表达明显提高TKI的药物作用；PTP H1过表达提升TKI药物对肿瘤细胞的抑制作用;EGFR/Y1173F过表达导致了乳腺癌细胞对TKI药物的耐药性,而且这种耐药性无法被PTPH1调节。最重要的是,免疫组化实验证实在临床标本中,PTPH1与EGFR蛋白水平呈明显的正相关。4. PTP H1可以降低EGF R与ER的相互作用。核浆分离实验证实,PTPH1不仅可以促进核内ER水平提高,而且促进了EGFR在细胞膜上的富集。免疫沉淀实验发现：PTPH1过表达可以降低EGFR与ER的结合,使EGFR-ER复合物水平降低；PTPH1/S459 A无法降低EGFR与ER的相互作用。结合相关细胞集落实验我们推测,EGFR与ER的相互作用可影响TKI药物的作用。5.ER的核内蛋白水平升高导致EGFR与ER的相互作用减弱。免疫沉淀实验发现：细胞质中的ER可以与EGFR相结合,产生EGFR-ER复合物；ER的突变体ER/T311A核内蛋白降低,与EGFR产生的复合物增加。相关细胞集落实验显示：ER/T311A过表达组与野生型ER过表达组相比,耐药性增强。我们推测EGFR-ER复合物导致了细胞对TKI产生耐药性。6. PTPH1提高乳腺癌细胞对TKI与他莫昔芬(TAM)联合用药的敏感性。细胞集落实验显示：PTPH1过表达可以分别提高TKI类药物或者他莫昔芬的作用；PTPH1过表达对于TKI与他莫昔芬联合用药效果的提升作用更为显著；PTPH1的突变体——没有去磷酸化作用的PTPH1/S459A无法提高乳腺癌细胞对TKI与他莫昔芬联合用药的敏感性。结论1. PTPH1增加乳腺癌细胞对TKI类药物的敏感性。2. PTP H1在体外细胞和乳腺癌细胞中均可对EGFR在Y1173位点进行去磷酸化。3. PTPH1通过对EGFR的Y1173位点的去磷酸化增加EGFR的稳定性。4.PTPH1通过催化活性降低EGFR-ER复合体的水平,从而提高TKI类药物与ER拮抗剂联合用药对乳腺癌细胞的抑制作用。意义本课题的实验结果表明,EGFR蛋白水平对于TKI类药物乳腺癌治疗的敏感性起到了关键性指示作用；经PTPHI调节,EGFR的关键残基Y1173在进行去磷酸化之后增加了EGFR稳定性,同时影响了TKI类药物的效果。首先,我们证实PTPH1可在Y1173位点对EGFR进行去磷酸化；其次,我们还发现PTPH1可以增强EGFR蛋白的稳定性和细胞膜EGFR蛋白水平。这些结果表明,PTPH1可能参与了EGFR磷酸化水平调节环路；最重要的是,PTPH1利用其磷酸催化活性增加了EGFR细胞膜定位,而且对Y1173位点去磷酸化以提升表皮生长因子受体EGFR蛋白的稳定性。此外,PTPH1不仅有己发现的对ER进行去磷酸化并增加其核移位的作用,还可以对EGFR的Y1173位点去磷酸化,促使EGFR向细胞膜富集,上述功能降低了EGFR-ER复合体生成,促进了EGFR靶向治疗药物的抗癌作用。综上,由PTPH1诱导的EGFR/Y1173去磷酸化上调乳腺癌EGFR膜受体可能是一种提高其靶向治疗药物临床效果的方法；结合PTPH1的ER核异位调节功能,PTPH1调节EGFR和ER相互作用的功能在乳腺癌联合用药治疗中有着重要的可研究价值,对于将来设计研究进一步克服药物治疗耐药性的课题提供了方向。