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肝脏是人体生物转化和解毒的重要器管。病毒、内毒素、代谢与免疫等因素可引起肝细胞损伤、坏死/凋亡。肝细胞坏死/凋亡是急、慢性肝脏疾病包括爆发性肝炎、肝纤维化等肝病的基本病理过程。肝纤维化是由于损伤的肝细胞释放的凋亡小体（apoptotic bodies），被库普弗细胞（kupffer cell）和肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）吞噬，释放炎症趋化因子和细胞因子，激活HSC和门脉成纤维细胞（portalfibroblast）转分化为肌成纤维细胞（myofibroblast, MyoFB），导致细胞外基质（extra-cellular matrix, ECM）过度沉积的病理过程。因此，保护肝细胞，减少肝细胞凋亡是治疗肝纤维化的重要策略。神经生长因子（nerve growth factor, NGF）由神经细胞和非神经细胞合成，调控细胞的分化、增殖及凋亡，是多效性的生长因子。NGF通过旁分泌或自分泌方式，调节神经营养素受体TrkANGFR（tropomyosin trkA tyrosine kinase receptor）和p75NTR（p75pan-neurotrophin receptor）的表达，调控成纤维细胞、炎症及免疫等细胞活性/凋亡，参与组织创伤-修复和组织重塑的病理生理过程。肝损伤时，增殖的肝细胞和活化的HSC合成NGF通过p75NTR信号传导途径诱导HSC分化/凋亡，调控肝损伤-修复病程。目前，NGF与p75NTR蛋白对肝细胞生物学作用的相关研究较少，本研究旨在探讨外源性重组人NGF和p75NTR蛋白对肝细胞生物学作用。本实验主要包括以下四部分第一部分：神经生长因子-β对D-半乳糖胺诱导L-02细胞损伤的保护作用目的：观察外源性神经生长因子-β（NGF-β）对D-半乳糖胺（D-galactosamine, D-GalN）诱导L-02细胞损伤的保护作用。方法：体外培养L-02细胞，用不同浓度的NGF-β预处理L-02细胞30min后，加入40mmol/L D-GalN诱导细胞损伤，水飞蓟宾（100mg/L）为阳性对照组，未予处理组为阴性对照，孵育24h，倒置显微镜下观察细胞形态学的变化，XTT法观察各组细胞活性，流式细胞仪（JC-1）法测细胞线粒体膜电位，比色法检测细胞培养上清液中的乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）、丙二醛（malondialdehyde, MDA）、白蛋白（Albumin,ALB）和细胞裂解液中谷胱甘肽（glutathione, GSH）的含量。结果：D-GalN孵育的L-02细胞膜不连续，呈球形，细胞核与细胞质的亮度对比明显降低；LDH、MDA浓度明显增加，ALB、GSH浓度明显降低；细胞活性、细胞线粒体膜电位明显下降。外源性NGF-β预处理组L-02细胞膜连续，细胞核与细胞质的亮度对比接近未受损伤细胞；NGF-β促进D-GalN损伤的L-02细胞增殖，LDH、MDA浓度明显降低，ALB、GSH浓度明显增加，细胞线粒体膜电位好转。结论：外源性NGF-β对D-GalN诱导损伤的L-02细胞有明显的保护作用，可能与NGF-β促进L-02细胞合成GSH抑制脂质过氧化反应和恢复线粒体膜电位有关。第二部分：NGF及TrkANGFR、p75NTR在人肝硬化组织及L-02细胞表达目的：观察人肝硬化组织和体外培养的L-02细胞NGF及受体TrkANGFR和p75NTR的表达。方法：免疫组织/细胞化学染色法观察人肝硬化组织石蜡切片和体外培养的L-02细胞NGF、TrkANGFR和p75NTR蛋白表达，Real-time PCR法观察L-02细胞NGF、TrkANGFR和p75NTRmRNA表达情况。结果：肝硬化组织石蜡切片和L-02细胞NGF、p75NTR、TrkANGFR免疫组织/细胞化学染色呈阳性，NGF主要位于肝细胞的细胞质和细胞核，TrkANGFR、p75NTR主要位于细胞膜和细胞质。Real-time PCR法L-02细胞表达NGF、TrkANGFR和p75NTRmRNA。结论：人肝硬化组织和L-02细胞检测到NGF、TrkANGFR和p75NTR的表达。第三部分：神经生长因子-β通过TrkANGFR信号途径促进L-02细胞增殖目的：观察外源性神经生长因子-（βNGF-β）对L-02细胞NGF及受体TrkANGFR和p75NTR表达的影响，NGF-β对L-02细胞的生物学作用。方法：体外培养L-02细胞，免疫细胞化学和荧光定量PCR法，分别检测NGF、TrkANGFR、p75NTR在L-02细胞中的表达。XTT法检测外源性NGF-β、anti-NGF、anti-TrkANGFR、anti-p75NTR对L-02细胞增殖作用的影响，流式细胞术（Annexin V/PI）及（PI）检测外源性NGF-β对L-02细胞凋亡及细胞周期的影响。结果：外源性NGF-β促进L-02细胞表达NGF及受体TrkANGFR、p75NTR；外源性NGF-β（12.5-200μg/L）促进L-02细胞有丝分裂，由G1期进入S期，促进细胞增殖、有抗细胞凋亡趋势，高剂量（>400μg/L）NGF-β不能促进L-02细胞增殖；anti-NGF、anti-TrkANGFR抑制NGF-β诱导的L-02细胞增殖，anti-p75NTR并不影响NGF-β诱导的L-02细胞增殖。结论：外源性NGF-β促进L-02细胞表达NGF及受体TrkANGFR、p75NTR；外源性NGF-β可能通过TrkANGFR信号途径促进L-02细胞增殖。第四部分：p75NTR蛋白体外通过TrkANGFR/p75NTR异源二聚体信号途径促进L-02细胞增殖目的：观察外源性p75NTR蛋白对L-02细胞表达NGF及受体TrkANGFR、p75NTR的影响，及外源性p75NTR蛋白对L-02细胞的生物学作用。方法：体外培养L-02细胞，免疫细胞化学和荧光定量PCR法，分别检测NGF、TrkANGFR、p75NTR在L-02细胞中的表达。XTT法检测外源性p75NTR、NGF-β、NGF-β+p75NTR、anti-TrkANGFR、anti-p75NTR对L-02细胞增殖作用，流式细胞术（AnnexinV/PI）及（PI）检测外源性p75NTR对L-02细胞凋亡及细胞周期的影响。结果：外源性p75NTR蛋白促进L-02细胞表达NGF及受体TrkANGFR、p75NTR；外源性p75NTR蛋白促进L-02细胞有丝分裂，由G1期进入S期，促进细胞增殖、有抗细胞凋亡趋势；外源性p75NTR与NGF-β协同促进L-02细胞增殖；anti-TrkANGFR抑制L-02细胞增殖，anti-p75NTR并不影响L-02细胞增殖。结论：外源性p75NTR蛋白上调L-02细胞NGF及受体TrkANGFR、p75NTR的表达，外源性p75NTR蛋白可能通过TrkANGFR/p75NTR异源二聚体信号途径促进L-02细胞增殖。