研究背景TNFRSF10B是一种TRAIL受体,属于TNF受体超家族。细胞凋亡过程中TNFRSFIOB定位于细胞膜,与配体TRAIL结合并发生三聚体化,进而招募FADD、 CASP8等形成死亡诱导信号复合体(DISC),启动CASP级联反应,诱导细胞凋亡。研究表明TNFRSFIOB在多种抗肿瘤试剂诱导的细胞凋亡中发挥重要作用。内质网应激是在某些生理或病理条件下,未折叠或错误折叠蛋白在内质网中聚集诱导的一系列反应。DDIT3是内质网应激下游调控细胞凋亡的重要转录因子,由内质网应激的三条通路EIF2AK3、ATF6、ERN1α共同调控。文献报道在肿瘤细胞中多种化疗药物如lonafarnib、MG132、CDDO-Me等通过DDIT3上调TNFRSF10B表达并诱导细胞凋亡。ATF4和ATF3均是内质网应激通路中的重要蛋白,多种刺激诱导它们表达上调。研究报道ATF3抑制DDIT3基因转录,而DDIT3则抑制ATF3蛋白的功能；同时也有文献报道ATF3促进DDIT3表达。MAPK1在不同类型的细胞和不同刺激下发挥促凋亡或抗凋亡作用。研究表明MAPK1增强多种细胞中cisplatin和celecoxib诱导的细胞凋亡。RPS6KA3是MAPK1的下游底物,属于Ser/Thr激酶家族,在细胞存活、增殖和凋亡中发挥双重作用。近期研究表明MAPK1和RPS6KA3通过调节ATF4和DDIT3的表达而影响TNFRSFIOB的表达。蛋白激酶C (protein kinase C, PKC)在调节细胞增殖和凋亡中起重要作用。一般认为PKCδ是促凋亡蛋白,凋亡刺激下PKCδ在调节亚基和催化亚基之间被切割,产生具有持续生物学活性的片段,该片段促进细胞凋亡。PKCα一般在细胞存活中发挥作用,但有研究发现它也促进细胞凋亡,如PKCα促进喜树碱诱导的凋亡。关于PKCα是否在PS-341诱导的细胞凋亡中发挥作用目前仍不清楚。很多前期数据表明蛋白酶体抑制剂PS-341单独或联合其他药物作用时具有明显的抗肿瘤效果,但是PS-341诱导细胞凋亡的具体分子机制仍不是很清楚。我们的前期实验已经证明PS-341诱导TNFRSF10B上调,所以本论文将进一步探讨在非小细胞肺癌细胞中PS-341诱导TNFRSF10B上调的分子机制。赖氨酸乙酰化在多种生物过程中发挥作用,例如细胞信号转导、细胞骨架动力学、代谢和DNA复制等。蛋白乙酰化和去乙酰化的平衡由乙酰转移酶和去乙酰化酶共同维持。越来越多的非组蛋白被证明发生乙酰化修饰,例如TP53.PKM2、 c-MYC、NF-κB、 a-tubulin等；乙酰化修饰影响蛋白的结构和功能。蛋白的乙酰化水平在多种肿瘤中都有明显变化,也是肿瘤形成一个重要因素,因此乙酰化是肿瘤治疗的一个重要靶点。蛋白甲基化主要由甲基转移酶催化,甲基化在蛋白相互作用、信号转导、转录和DNA修复等过程发挥作用。肽基精氨酸去亚胺酶4(PADl4)是2004年发现的组蛋白去甲基化酶,负责组蛋白精氨酸残基上单甲基化的去甲基化,并催化精氨酸变成瓜氨酸；同时调节非组蛋白的去甲基化,例如EP300、RPS2、ING4和nucleophosmin/B23等。CFLAR是CASP8/10特异的抑制蛋白,能被招募到DISC上,抑制PROCASP8/10切割活化。CFLAR在多种肿瘤如肝癌、结肠癌、黑色素瘤、卵巢癌中高表达；很多小分子药物通过降低CFLAR蛋白水平诱导细胞凋亡,所以CFLAR是一个很有前景的肿瘤治疗靶标。研究表明CFLARL与XRCC6结合而稳定CFLARL,乙酰化的XRCC6干扰CFLARL/XRCC6复合物的形成,从而促使CFLARL泛素化降解。但是目前仍不确定CFLARL存在乙酰化修饰。质谱实验表明CFLARL含有一个甲基化位点。我们的目的是确定CFLARL是否存在乙酰化和甲基化修饰,并研究翻译后修饰的CFLARL在细胞中的作用和调控机制。研究方法1.利用siRNA干扰和基因过表达实验研究特定蛋白在信号转导通路中的作用；2.利用SRB实验检测肿瘤细胞存活率；3.利用western Blot实验检测细胞内相关蛋白表达水平；4.利用免疫共沉淀和GST pull down实验研究蛋白间相互作用和特定蛋白的翻译后修饰；5.利用流式细胞术检测细胞凋亡；6.利用荧光显微镜观察蛋白在细胞中的定位。实验结果1.蛋白酶体抑制剂PS-341显著诱导DDIT3表达,并呈剂量和时间依赖性。2.在DDIT3 siRNA转染的细胞中,PS-341诱导的TNFRSF10B水平明显降低,CASP8、CASP9、CASP3、PARP1的切割片段减少；流式细胞分析法检测细胞凋亡,发现在DDIT3 siRNA转染的细胞中,PS-341诱导的细胞凋亡降低。3.PS-341诱导内质网应激相关蛋白如ATF、ATF3、HSPA5、p-EIF2S1和ERNlα表达,并呈剂量和时间依赖性。4. Western blot实验表明,在对照siRNA转染的细胞中,PS-341诱导TNFRSF10B上调,CASP8、CASP9、CASP3活化和PARP1失活,但在ATF3 siRNA转染的细胞中这些现象受到明显抑制；SRB实验显示抑制ATF3增强了肿瘤细胞的存活：流式细胞术分析细胞凋亡发现PS-341诱导的对照siRNA转染的细胞凋亡率为41%,ATF3 siRNA转染的凋亡细胞只有26%。5.在H460、A549、H157细胞中,敲低ATF4表达抑制PS-341诱导的TNFRSF10B上调和CASP级联反应,同时PS-341诱导的细胞凋亡百分比从29%降低到19%。6.在H460、A549、H157细胞中,抑制ATF4表达降低了PS-341诱导的ATF3和DDIT3上调；在H157和Calu-1细胞中,抑制ATF3表达,PS-341诱导的DDIT3上调受到轻微抑制,但ATF4表达不变；另一方面,敲低DDIT3表达,ATF3表达轻微降低,ATF4表达仍没有变化。利用蛋白质免疫共沉淀技术进一步研究ATF3和DDIT3之间的关系,发现DDIT3与ATF3相互结合形成复合物。7.当PS-341作用于细胞时,MAPK1和RPS6KA3的磷酸化水平明显升高,并呈剂量和时间依赖性。在多种细胞中,用MRK特异抑制剂U0126抑制MAPK1和RPS6KA3活化,发现PS-341诱导的TNFRSF10B上调受到显著抑制。8. Western blot实验发现PS-341诱导PKCδ切割活化,产生41kD片段,并呈剂量和时间依赖性。9.用siRNA干扰技术抑制PKCδ表达,发现PS-341诱导的TNFRSF10B上调受到明显抑制,而且CASP8、CASP9、CASP3和PARP1的切割形式明显降低；而过表达PKCδ之后,PS-341诱导的TNFRSF10B和CASP级联反应明显增强；SRB实验显示对照siRNA转染的细胞在PS-341处理时细胞存活率更低；流式细胞分析法检测细胞凋亡发现PKC8 siRNA转染后PS-341诱导的细胞凋亡从41%降为23%。10.抑制PKC8表达后,PS-341诱导的MAPK1和RPS6KA3的磷酸化受到抑制,内质网应激相关蛋白ATF4、ATF3和DDIT3的诱导也受到明显抑制。11.在H157细胞中转染pEGFP-PKC8质粒,发现PS-341诱导PKCδ发生核转位。12.用siRNA干扰技术抑制PKCa表达后,PS-341诱导的TNFRSF10OB上调受到抑制,CASP级联反应明显降低,内质网应激相关蛋白ATF4、ATF3和DDIT3上调也受到抑制。13.在H157细胞中转染pEGFP-PKCa质粒,发现PKCa主要分布于细胞质,PS-341不能引起PKCa发生核转位。14.在H1792和A549中敲低PADI4、CFLARL表达明显降低。15.在细胞中同时转染PADI4 siRNA和pcDNA3.1-CFLARL-Flag或pEBG-CFLARL质粒,免疫共沉淀或GST pull down实验发现抑制PADI4表达增强了CFLARL与XRCC6结合。16.在细胞中过表达CFLARL后进行GST pull down实验,western blot发现CFLARL存在精氨酸甲基化修饰。17.将CFLARL的Arg122突变为Ala,然后在细胞中转染pEBG-CFLARL和pEBG-CFLARL-R122A质粒并进行GST pull down实验,发现CFLARL-R122A与XRCC6的结合比CFLARL与XRCC6结合低。18.在293FT或H1792细胞中过表达CFLARL和CFLARL-R122A,用CHX处理,发现细胞中CFLARL-R122A的降解速率要低于CFLARL的降解速率。19.在H1792细胞中转染pEGFP-CFLARL与pEGFP-CFLARL-R122A质粒或pEBG-CFLARl与pEBG-CFLARL-R122A质粒,并用SAHA处理,发现在过表达CFLARL-R122A的细胞中,SAHA诱导的凋亡相关蛋白CASP8、 CASP3的活化和PARP1的失活明显降低。20.蛋白质免疫沉淀实验显示CFLARL存在乙酰化修饰。结论1.PS-341增加非小细胞肺癌细胞中DDIT3表达,DDIT3增强PS-341诱导的TNFRSF10B上调和细胞凋亡。2.PS-341激活非小细胞肺癌细胞中内质网应激反应。3.ATF3增强PS-341诱导的TNFRSF10B上调和细胞凋亡。4.ATF4促进PS-341诱导的TNFRSF10B表达和细胞凋亡。5.ATF4上调ATF3和DDIT3表达,ATF3和DDIT3形成复合物共同调节TNFRSF10B的表达。6. MAPK1/RPS6KA3信号通路调控PS-341诱导的TNFRSF10B表达。7.PS-341切割活化PKC△并诱导PKC△发生核转位；PKC△通过MAPK1/RPS6KA3信号通路和随后的内质网应激反应促进PS-341诱导的TNFRSF10B表达和细胞凋亡。8.PKCA通过内质网应激反应增强PS-341诱导的TNFRSF10B表达和细胞凋亡。9.抑制PADI4表达抑制了CFLARL 的表达并促进了CFLARL与XRCC6结合。10. CFLARL存在精氨酸甲基化修饰。11.抑制CFLARL的精氨酸甲基化抑制了CFLARL与XRCC6结合,增加了CFLARL的稳定性并降低了SAHA诱导的细胞凋亡。12. CFLARl存在乙酰化修饰。总地来说,本研究发现在非小细胞肺癌细胞中PS-341诱导PKC5依赖的TNFRSF10B表达,主要通过MAPK1/RPS6KA3信号通路和随后的内质网应激反应；PKCa也通过内质网应激反应促进PS-341诱导的TNFRSF10B表达和细胞凋亡。另外我们首次证实CFLARL存在乙酰化和精氨酸甲基化修饰；抑制CFLARL的精氨酸甲基化修饰抑制CFLARL与XRCC6结合,增加CFLARL的稳定性并降低SAHA诱导的细胞凋亡。