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低氧诱导因子-1(Hypoxia-inducible factor,HIF-1)是由同属bHLH/PAS基因家族的基础型表达的β亚单位和受氧浓度严格调节的α亚单位组成的异源二聚体转录因子。HIF-1是生理性和病理性低氧过程中最主要的效应因子,其作用非常广泛,几乎所有与低氧有关的基因均受其直接或间接调节。作为一个受到广泛关注的明星分子,当前几乎每天都有关于HIF-1的研究结果被报道,主要集中在新靶基因的发现及它们的生物学功能,HIF-1自身稳定性及转录活性的调节等。近来,越来越多的证据表明,低氧和/或HIF-1也能够调控(诱导或抑制)某些组织细胞比如造血干细胞、神经干细胞、成肌细胞、胚胎滋养层细胞、肺动脉成纤维细胞等的分化。
最近,我们课题组通过体外和体内实验证实了中度低氧和低氧模拟物[氯化钴(COCl2)和去铁敏(desferrioxamine,DFO)]能够诱导急性髓系白血病(AcuteMyeloid Leukemia,AML)细胞发生分化,而这一过程可能是由HIF-1α蛋白所介导的。为此,本文的工作主要围绕HIF-1α与AML细胞分化,旨在证实HIF-1α是否是低氧诱导AML细胞分化的关键因子,在此基础上挖掘HIF-1α和全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)诱导白血病细胞分化的关系,并深入探讨HIF-1α诱导AML细胞分化的分子机制,主要取得如下研究成果:
(1)HIF-1α的确是低氧诱导细胞分化的重要执行者。我们利用核糖核酸干预技术(RNA interference,RNAi)特异性地抑制HIF-1α的表达后,低氧及其模拟化合物引起的AML细胞分化被明显削弱。同时,采用四环素-关闭(Tetracycline-Off Tet-Off)基因表达系统建立诱导表达HIF-1α的AML细胞系,证实了HIF-1α的表达可以直接引起AML细胞向粒系分化。
(2)HIF-1α在ATRA介导的白血病细胞分化的过程中发挥了重要作用。ATRA处理白血病细胞分化的同时,可以迅速累积内源性的、诱导表达的以及COCl2稳定的HIF-1α蛋白。更为重要的是,当HIF-1α的表达被人为地特异性抑制后,ATRA诱导的分化效应被部分而又显著地抑制;而利用四环素诱导表达系统或者COCl2高表达HIF-1α蛋白之后,ATRA诱导的分化效应被明显的协同加强。
(3)低氧/HIF-1α诱导AML细胞分化不依赖HIF-1自身的转录活性,而是通过调节造血相关转录因子如CCAAT/增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer-binding proteinα,C/EBPa)和Runx1等的转录活性从而促使AML细胞分化成熟。通过RNAi特异性地抑制HIF-1β表达可以明显抑制低氧引起的HIF-1靶基因的上调,但AML细胞分化并未受到影响。在此基础上,我们利用巨噬细胞集落刺激因子受体(Macrophage Colony-Stimulating Factor Receptor,M-CSFR)在低氧/HIF-1α诱导分化时会特异性升高这一重要线索(文献报导该基因可被C/EBPα、Runx1和PU.1协同调控),通过荧光素酶活性检测实验发现HIF-1α可以增强C/EBPα、Runx1和PU.1的转录活性。进一步地,通过特异性地抑制它们的表达,证实了这三个转录因子对于低氧/HIF-1α诱导分化的重要贡献,以及它们在HIF-1α和ATRA协同诱导分化中的重要作用。
综上所述,依靠Tet-Off、RNAi等技术平台,本文第一次明确了HIF-1α在低氧以及低氧模拟化合物诱导AML细胞分化中的重要作用,发现这一功能并不依赖于HIF-1自身的转录活性,而是通过增强髓系造血相关的重要调节因子的转录活性,从而引起AML细胞向粒系分化成熟;在此基础上,我们报导了ATRA在常氧下也可以迅速累积HIF-1α蛋白,并且HIF-1α蛋白的累积在ATRA诱导的白血病细胞分化中发挥了一定的作用。这些工作既拓展了人们对于HIF-1α蛋白功能的认识,构建了低氧效应网络中一条非常独特的信号通路,又开辟了ATRA诱导白血病细胞分化的新机制,为认识白血病细胞分化及生理造血提供了重要的理论基础,同时也为识别诱导分化治疗白血病的药物靶标提供了新的线索。