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肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)作为全球高发恶性肿瘤之一,严重威胁人类健康,而我国更是肝细胞癌高发国家。跨膜转录因子Nrf1 (nuclear factor-erythroid 2 related factor 1)属于碱性亮氨酸拉链CNC-bZIP (cap’n’collar basic-region leucine zipper)亚家族成员,通过调控抗氧化基因、蛋白酶体基因的转录,保护细胞免受氧化应激影响,维持机体内平衡。而Nrfl肝脏特异敲除的小鼠诱发原发性肝细胞癌,为了更深入揭示Nrfl与肝细胞癌的发病机制,我们选择人肝癌细胞HepG2作为研究对象,观察Nrfl a (Nrfl全长亚型)对肝癌细胞HepG2恶性行为的影响。而且Nrf1a是否发挥肿瘤抑制因子的作用也未见报道。因此我们将研究聚焦于此,探讨Nrf1α在肝细胞癌发生发展中的生物学功能及其机制,为Nrfl缺失诱发肝细胞癌的发病机理、临床病理及预后判断提供新的思路。研究方法与结果：① TALEN (transcription activator-like effector nuclease)介导同源双敲除Nrfl a肝癌细胞株的建立通过TaqMan探针和DNA测序技术分别检测Nrf1的两种全长亚型Nrf1α和TCF11,发现TCF11亚型在不同肝癌细胞中明显低表达,而正常肝细胞Nrf1α和TCF11表达丰度接近一致。因此,我们选择低表达TCF11的HepG2细胞作为研究对象。接下来构建TALEN介导敲除Nrf1α的HepG2细胞株,根据TALEN敲基因原理,我们分别设计TALEN左臂不PTALEN右臂,经过质粒共转染细胞,细胞测序验证,单克隆筛选,成功获得同源双敲除Nrf1α-/-的HepG2细胞株,命名为HEA157(Nrf1α-/-)。为了对照验证,我们设计了沉默Nrf1的慢病毒载体,筛选出沉默Nrf1最有效的shRNA靶序列,建立稳定敲减Nrfl细胞株,命名为HepG2-shNrf1。最后,我们设计了Nrf1 a超表达慢病毒载体,转染HEA157(Nrf1α-/-)细胞,获得稳定异源恢复表达Nrf1α的细胞株,命名为HEA157Nrf1α。② TALEN介导敲除Nrf1α对肝癌细胞生物学行为的影响MTS、细胞克隆形成实验检测细胞增殖,结果均提示在Hep(G2细胞中敲除Nrf1α可促进细胞增殖。流式细胞仪测定细胞凋亡,结果显示,HEA157(Nrf1α-/-)细胞晚期凋亡率明显降低,但早期凋亡并没有明显变化。细胞划痕及Transwell侵袭迁移实验观察细胞运动能力,实验结果显示,敲除Nrf1α后肝癌细胞迁移及侵袭能力均显著增强(p<0.05)。综合实验结果分析,Nrf1α能够对肝癌细胞生物学行为进行调节,通过调控肝癌细胞增殖和EMT发生增强肝癌细胞迁移侵袭能力。促进肝癌细胞体外恶性转化。③敲除Nrf1α调控肝癌细胞迁移侵袭的机制探究检测4HEA157(Nrfla-/-)细胞中与肿瘤转移相关基因的表达,发现MMP-9、 MMP-17表达显著升高,上皮细胞标志物CDH1表达显著下调(p<0.01)。间质细胞标志物CDH2表达显著上调(p<0.01)。Western Blot分析CDH1、CDH2、SNAI1、 SNAI2、Vimentin的表达也证实敲除Nrf1α促进肝癌细胞发生上皮间质转化。通过建立裸鼠皮下移植瘤模型,发现HEA157(Nrf1α-/-)细胞形成的移植瘤生长速度更快,在注射细胞后的20-35天,移植瘤呈现指数生长。且最终形成的移植瘤体积更大,并伴随溃烂出血。同时发现HEA157(Nrf1α-/-)组小鼠肝脏出现大量转移癌结节。免疫组化检测模型鼠移植瘤Nrf1、CDH1、CDH2的表达,发现HEA157(Nrf1α-/-)实验组Nrf1表达减少,CDH1表达下调,CDH2表达上调。Real-time PCR检测结果与免疫组织化学结果一致。实时定量PCR实验,Western Blot及免疫组织化学方法检测发现Nrfl在HCC组织中的表达与病理严重程度呈现相关性,高分化HCC组织Nrfl高表达,低分化HCC组织Nrf1低表达,且癌旁组织表达丰度高于癌组织。通过高通量表达谱测序及信号通路聚类分析,发现敲除Nrfα激活HepG2细胞PTEN-PI3K/AK T信号通路。进一步实验验证敲除Nrf1α, PTEN表达下调,PIK3CA、 PIK3CB表达上调,AKT2总蛋白表达并未发生明显变化,但p-AKT2T308和p-AKT2S473磷酸化水平加强。启动子分析和双荧光素酶检测结果提示Nrf1α与PTEN、 CDH1存在直接作用关系。因此,我们认为下调Nrfα表达激活PTEN-PI3K/AK T信号通路,促进AKT的活化并促进PI3K/AKT下游靶基因表达。结论：①利用TALEN基因定点编辑技术,成功构建敲除Nrf1α亚型的HepG2肝癌细胞株HEA157(Nrf1α-/-)。②Nrf1α缺失促进肝癌细胞EMT发生,并导致裸鼠皮下移植瘤肝脏转移,促进肝癌细胞恶性迁移侵袭能力显著增强。③Nrf1在HCC组织中的表达与病理严重程度呈现相关性,高分化HCC组织Nrfl高表达,低分化HCC组织Nrf1低表达,且癌旁组织表达丰度高于癌组织。④下调Nrfα表达激活PTEN-PI3K/AKT信号通路,促进AKT的活化并促进PI3K/AKT下游靶基因表达。