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来自嗜盐微生物的嗜盐酶不仅可以在高盐的环境中生存,且可以保持较好的稳定性及活性,为探究这类特殊的嗜盐酶在高盐环境中的盐适应机制,本文以来源于海洋Pseudoalteromonas spongiae菌株的亮氨酸脱氢酶(以下简称psLeuDH)为研究体系,对酶进行理性设计并采用分子动力学模拟的方法模拟酶在不同盐浓度的模拟过程中的动态变化尝试解释酶的盐适应性。首先对psLeuDH酶进行了耐盐性质的研究,测定了 psLeuDH分别在0、1、2、3、4、5M盐浓度条件下的酶活。结果表明psLeuDH为极端耐盐酶,因此可以以该酶为研究体系进行酶的耐盐机制的研究。采用同源建模方法获得psLeuDH蛋白三维结构,对酶结构进行分析,并在前人的研究基础上对酶进行理性设计以改变酶的耐盐性程度,分别以降低酶盐依赖性和提高酶耐盐性为目的对蛋白表面的残基进行突变,突变后经全基因合成获得了两组突变体M1、M2和M3、M4及其三维结构模型。对突变体M1、M2和M3、M4进行耐盐实验验证,实验结果表明:(1)降低M1、M2蛋白表面酸性氨基酸含量能够降低酶对高盐环境的盐依赖性;(2)增加M3表面酸性氨基酸的含量能大大提高酶在高盐环境中的耐盐性,M4丧失活性。采用NAMD软件分别对酶psLeuDH、M1、M2和M3在温度为298 K盐浓度分别为0、2、3 M的条件下进行时长50ns的分子动力学模拟,探究不同盐浓度对酶的稳定性、溶解性、活性的影响。模拟结果表明:(1)与psLeuDH相比,M3的耐盐性最好,在3M的高盐环境下有着更好的稳定性;(2)psLeuDH、M1、M2在模拟过程中不同盐浓度下回旋半径发生不同程度的减小,代表结构发生了收缩,尤其在其适宜的盐浓度下结构更为紧凑,M3同样显示在高盐浓度下结构最为紧凑,而紧凑的结构有助于加快催化过程中活性位点间质子传递效率,从而提高催化效率;(3)随着盐浓度增加,psLeuDH、M1、M2的SASA值大幅度的减小,说明在高盐浓度下酶与溶剂间的亲和力减弱,M3的SASA结果表明其在高盐环境中有着稳定的溶解性,这与M3的耐盐性质相符;(4)psLeuDH、M1、M2、M3在3 M盐浓度条件下的表面离子分布显示,突变后的M1、M2表面的钠离子层与psLeuDH相比较弱,M3则可形成更稳定的钠离子水合层,水合层越稳定,蛋白与溶剂间氢键数目越多,有助于蛋白在溶液中稳定存在;(5)观察活性中心附近离子发现,在不同盐浓度及不同酶体系中C1-与Lys68、Lys80位侧链间的静电相互作用有着较大差异,盐浓度越高,Cl-与Lys68、Lys80位侧链间的静电相互作用也就越稳定,体系耐盐性越好,作用也越稳定如M3,推测该原因可能导致了酶在不同的盐浓度中活性的差异。