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新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的鸡和多种禽类的急性高度接触性传染病，主要特征为呼吸困难、神经紊乱、黏膜和浆膜出血，是危害养禽业的重大疫病之一。目前，我国对鸡群实施以ND疫苗强制免疫为主的防控策略，使得NDV的流行得到了很好的控制。为检测鸡群ND疫苗免疫状况，通常对疫苗免疫后的鸡群进行NDV抗体检测，以有效评估鸡群的免疫效果。目前，主要应用血凝抑制(HI)方法对NDV抗体进行评估，但该方法操作步骤多、工作量大、难以实现自动化检测，且判定结果易受红细胞质量、人为主观判定等因素影响。因此，开发出一种易于标准化、适合大量血清样品检测的血清学方法具有重要意义。为了建立检测NDV抗体的血清学方法，本研究拟建立两种ELISA方法，一种为基于NDV多肽检测NDV抗体的间接ELISA方法，另一种为基于NDV单抗建立的检测NDV抗体的竞争ELISA方法。
1.基于NDV多肽检测NDV抗体的ELISA方法的建立
在NDV的HN蛋白和F蛋白序列分析的基础上，通过blast软件分析其保守性及特异性位点，并综合分析蛋白的B细胞表位，共筛选出4种抗原表位多肽序列，其中F蛋白的候选多肽命名为NDV-F，HN蛋白的候选多肽分别命名为NDV-H1、NDV-H2、NDV-H3，并将其进行人工合成。合成后的多肽与BSA载体蛋白偶联，作为包被抗原，筛选适用于检测NDV抗体的间接ELISA方法的多肽。
通过将4种多肽包被酶标板，检测NDV阳性血清和阴性血清，确定了检测NDV抗体的最适多肽为NDV-H3。方阵滴定结果表明，NDV-H3多肽的最佳包被浓度为1.42μg/mL，血清的最佳稀释度为1︰40。该ELISA方法与禽流感病毒(AIV)H5亚型、AIV-H7亚型、AIV-H9亚型、鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)阳性血清无交叉反应，具有良好的特异性。用建立的ELISA方法与HI方法同时对112份临床鸡血清样品进行检测，其中阳性血清67份，阴性血清45份，与HI方法相比，该方法的阳性符合率为94.0%，阴性符合率为100%，总符合率为96.4%。建立的ELISA方法对血清中NDV抗体水平的检测具有较高的灵敏度和很好的特异性，可用于临床NDV抗体效价的检测。
2.NDV单克隆抗体的制备及竞争ELISA方法的建立
利用鸡胚扩增NDV并进行病毒浓缩与灭活，将其作为抗原免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、阳性杂交瘤细胞筛选、杂交瘤细胞单克隆化等一系列操作，最终获得3株阳性杂交瘤细胞株，分别命名为2G8、5G7、3F2。通过以NDV-Ⅰ型、NDV-Ⅱ型、NDV-Ⅵ型、NDV-Ⅶ型、AIV-H7亚型、AIV-H9亚型、阴性鸡胚尿囊液作为ELISA抗原，检测3株单抗的特异性，其中2G8抗体仅与NDV-Ⅵ型抗原发生反应；5G7抗体可与NDV-Ⅱ型、NDV-Ⅵ型和NDV-Ⅶ型发生反应，且与NDV-Ⅵ型的反应性最强；3F2抗体可与NDV-Ⅰ型、NDV-Ⅱ型和NDV-Ⅵ型抗原发生反应，且与NDV-Ⅱ型的反应性最强，同时这3种抗体均不与AIV-H7亚型、AIV-H9亚型和阴性鸡胚尿囊液发生交叉反应，特异性良好。
在本研究研制的3株NDV单克隆抗体中，3F2单抗与NDV-Ⅱ型反应性最强，因此基于3F2单抗建立检测NDV抗体的竞争ELISA方法。通过对单抗腹水的制备和纯化，并对纯化后抗体进行辣根过氧化物酶(HRP)标记，用于竞争ELISA方法的建立。应用竞争ELISA方法对血清进行检测时发现，该方法不能对NDV临床阳性血清及阴性血清进行区分，因此，3F2抗体不适合用于竞争ELISA方法的建立。
本研究通过筛选出可用于检测NDV抗体的NDV-H3多肽，并以该多肽作为抗原初步建立了检测NDV抗体的间接ELISA方法。同时，本研究研制了3株NDV单克隆抗体。
1.基于NDV多肽检测NDV抗体的ELISA方法的建立
在NDV的HN蛋白和F蛋白序列分析的基础上，通过blast软件分析其保守性及特异性位点，并综合分析蛋白的B细胞表位，共筛选出4种抗原表位多肽序列，其中F蛋白的候选多肽命名为NDV-F，HN蛋白的候选多肽分别命名为NDV-H1、NDV-H2、NDV-H3，并将其进行人工合成。合成后的多肽与BSA载体蛋白偶联，作为包被抗原，筛选适用于检测NDV抗体的间接ELISA方法的多肽。
通过将4种多肽包被酶标板，检测NDV阳性血清和阴性血清，确定了检测NDV抗体的最适多肽为NDV-H3。方阵滴定结果表明，NDV-H3多肽的最佳包被浓度为1.42μg/mL，血清的最佳稀释度为1︰40。该ELISA方法与禽流感病毒(AIV)H5亚型、AIV-H7亚型、AIV-H9亚型、鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)阳性血清无交叉反应，具有良好的特异性。用建立的ELISA方法与HI方法同时对112份临床鸡血清样品进行检测，其中阳性血清67份，阴性血清45份，与HI方法相比，该方法的阳性符合率为94.0%，阴性符合率为100%，总符合率为96.4%。建立的ELISA方法对血清中NDV抗体水平的检测具有较高的灵敏度和很好的特异性，可用于临床NDV抗体效价的检测。
2.NDV单克隆抗体的制备及竞争ELISA方法的建立
利用鸡胚扩增NDV并进行病毒浓缩与灭活，将其作为抗原免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、阳性杂交瘤细胞筛选、杂交瘤细胞单克隆化等一系列操作，最终获得3株阳性杂交瘤细胞株，分别命名为2G8、5G7、3F2。通过以NDV-Ⅰ型、NDV-Ⅱ型、NDV-Ⅵ型、NDV-Ⅶ型、AIV-H7亚型、AIV-H9亚型、阴性鸡胚尿囊液作为ELISA抗原，检测3株单抗的特异性，其中2G8抗体仅与NDV-Ⅵ型抗原发生反应；5G7抗体可与NDV-Ⅱ型、NDV-Ⅵ型和NDV-Ⅶ型发生反应，且与NDV-Ⅵ型的反应性最强；3F2抗体可与NDV-Ⅰ型、NDV-Ⅱ型和NDV-Ⅵ型抗原发生反应，且与NDV-Ⅱ型的反应性最强，同时这3种抗体均不与AIV-H7亚型、AIV-H9亚型和阴性鸡胚尿囊液发生交叉反应，特异性良好。
在本研究研制的3株NDV单克隆抗体中，3F2单抗与NDV-Ⅱ型反应性最强，因此基于3F2单抗建立检测NDV抗体的竞争ELISA方法。通过对单抗腹水的制备和纯化，并对纯化后抗体进行辣根过氧化物酶(HRP)标记，用于竞争ELISA方法的建立。应用竞争ELISA方法对血清进行检测时发现，该方法不能对NDV临床阳性血清及阴性血清进行区分，因此，3F2抗体不适合用于竞争ELISA方法的建立。
本研究通过筛选出可用于检测NDV抗体的NDV-H3多肽，并以该多肽作为抗原初步建立了检测NDV抗体的间接ELISA方法。同时，本研究研制了3株NDV单克隆抗体。