动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是一种脂代谢紊乱及慢性炎症性疾病，严重危害人类健康。目前AS发病率仍然很高，据WHO预测，到2050年，全球将有三分之一的死亡由以AS为病理基础的心脑血管疾病引起。 AS最早期肉眼可见的损伤是脂质条纹，主要由摄取了大量胆固醇的巨噬细胞源泡沫细胞构成。血液循环中的单核细胞在动脉易损部位黏附到活性内皮细胞，并进一步分化为巨噬细胞。此时巨噬细胞上表达大量的清道夫受体，并通过该类受体介导的胞吞作用吞噬脂质(包括胆固醇以及脂质过氧化物)。巨噬细胞大量蓄积脂质并逐渐转变成富含胆固醇的巨噬泡沫细胞。巨噬泡沫细胞形成后不断堆积，形成动脉壁脂肪条纹，伴随着内皮细胞增生和内膜基底层平滑肌细胞的移行和增生，则逐渐构成了动脉粥样斑块早期损伤和脂质条纹的主体。 抑制巨噬泡沫细胞的形成或者促进巨噬细胞内胆固醇的外流是减少巨噬泡沫细胞的主要措施。胆固醇从巨噬细胞的流出是体内胆固醇逆向转运的启动环节。胆固醇逆向转运(reverse cholesterol transport，RCT)是外周细胞胆固醇通过高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)转运至肝脏转化、清除的重要生理过程。巨噬细胞内胆固醇的流出对维持细胞胆固醇的平衡，促进胆固醇的逆转运及抗动脉粥样硬化都起着非常重要的作用。因此减少巨噬细胞内的胆固醇的聚积，促进细胞内胆固醇的外流，让泡沫化过程逆转目前已经成为AS预防与治疗的新的途径。 在对AS的研究中，烟酸的抗AS效应一直是关注的焦点。烟酸又称尼克酸、维生素PP，是B族维生素大家族中的一员。早在1955年，Altshul和Hoffer就开始将烟酸作为一种调脂药物。目前，烟酸已经广泛应用于临床调节血脂异常，包括降低总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL—C)、极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL—C)、甘油三脂(TG)、载脂蛋白B(apoB)；同时，能够有效的升高高密度脂蛋白胆固醇(HDL—C)。最新研究发现烟酸还表现出抗炎，抗氧化及改善血管内皮等对AS有益的作用。大规模的临床实验也证实其能预防心血管疾病及降低病死率。可以看出，烟酸有很强的抗AS效应。 特别值得一提的是，烟酸是目前最有效的升高HDL的调脂药，但其机制一直未完全阐明。研究表明HDL对AS的保护作用的机制之一就是因为RCT。流行病学和体外研究发现，烟酸能选择性的升高LPA—I(只含apoA—I的HDL)达24％，并呈剂量依赖性关系，同时抑制了肝脏对LPA—I的摄取，从而引起LPA—I在循环中的贮留，后者在RCT中是胆固醇酯的一个很好的供体。这提示烟酸在胆固醇外流和RCT中可能起到很重要的调节作用。为了明确烟酸对胆固醇外流和RCT的调控作用，我们用小鼠腹腔巨噬泡沫细胞为研究模型，探讨烟酸对胆固醇外流的影响及核受体调控机制，这些体外资料将为烟酸升高HDL机制研究以及深入研究烟酸抗AS效应提供依据。 研究目的: 1.研究烟酸对小鼠腹腔巨噬泡沫细胞胆固醇外流的影响2.探讨烟酸影响胆固醇外流的可能核受体调控机制研究. 方法: 1.小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养和巨噬泡沫细胞模型的建立NIH小鼠颈椎脱臼处死，PBS注入小鼠腹腔，轻柔小鼠腹部，无菌吸管吸出腹腔内PBS，收集于离心管中。4℃，3000rpm，离心10min。重复洗三次；离心后所得细胞重悬于RPMI-1640培养基中，以2X106个细胞/ml的密度接种到12孔板。置于CO2培养箱中37℃，5％CO2，孵育三小时后洗去未贴壁细胞。 密度梯度离心法提取血浆中的LDL，硫酸铜对其氧化修饰成oxLDL。每孔加入浓度为50μg/ml的oxLDL，孵育24h转变为巨噬泡沫细胞。 2.烟酸对巨噬泡沫细胞胆固醇外流的影响将巨噬泡沫细胞分别与0.25mM、0.5mM和1mM烟酸培养24h，或者与1mM烟酸分别培养0h、12h、24h、36h，再与10μg/mlapoAI孵育24h，酶法检测细胞和培养液中胆固醇的含量。 将[3H]负载的巨噬泡沫细胞分别与0.25mM、0.5mM和1mM烟酸培养24h，再与10μg/mlapoAI孵育24h，检测培养液中胆固醇的含量。 3.烟酸对小鼠腹腔巨噬细胞脂质蓄积的影响将巨噬细胞分别与0.25mM、0.5mM和1mM烟酸孵育2h后，加入50μg/ml的oxLDL培养24h，检测细胞和培养液中胆固醇的含量。 4.烟酸对巨噬细胞ABCA1、ABCG1、LXRα、PPARγmRNA表达影响将巨噬泡沫细胞分别与0.25mM、0.5mM和1mM烟酸培养24h，提取总RNA，荧光定量PCR法检测ABCA1、ABCG1、LXRα、PPARγmRNA表达5.放线菌素D或DIDS对胆固醇外流、ABCA1、ABCG1表达的影响用5μg/ml转录抑制剂放线菌素D与1mM烟酸共同培养巨噬泡沫细胞24h。检测胆固醇的外流及ABCA1、ABCG1的表达；400μMABCA1的特异性阻断剂DIDS与1mM烟酸共同培养巨噬泡沫细胞24h。检测胆固醇的外流。 6.GGPP和GW9662对ABCA1表达和胆固醇的外流的影响将10μMLXRα的抑制剂GGPP或PPARγ抑制剂GW9662与1mM烟酸共同培养巨噬泡沫细胞24h。检测胆固醇的外流及ABCA1、ABCG1的表达。 7.GW9662对LXRα表达影响将10μMPPARγ，抑制剂GW9662与1mM共同培养巨噬泡沫细胞24h，检测LXRα表达。 研究结果: 1.烟酸促进巨噬泡沫细胞胆固醇外流与对照组相比，0.25mM、0.5mM和1mM烟酸培养巨噬泡沫细胞24h后，均能促进胆固醇(包括总胆固醇、游离胆固醇)外流(p<0.01或p<0.001)。总胆固醇外流率分别为对照组的1.4倍、1.7倍和2.1倍，游离胆固醇外流率分别为对照组的1.5倍、1.8倍和2.3倍，呈明显的剂量—效应关系。 与0h相比，1mM烟酸培养巨噬泡沫细胞12h、24h、36h后，均能促进胆固醇(包括总胆固醇、游离胆固醇)外流(p<0.01)，且在24h时胆固醇的外流达到最大，这一作用存在明显的时间—效应关系。 与对照组相比，0.25mM、0.5mM和1mM烟酸均能够促进巨噬泡沫细胞[3H]胆固醇的外流，外流率分别为对照组的1.5倍、2.1倍和3.2倍，差异具有显著性(p<0.01或p<0.001)。 2.烟酸对巨噬细胞脂质蓄积的影响巨噬细胞与0.25mM、0.5mM和1mM烟酸培养24h后，与对照组相比，oxLDL组细胞总胆固醇和游离胆固醇增加(p<0.05)；与oxLDL组相比，不同浓度烟酸组细胞总胆固醇和游离胆固醇没有差别(p>0.05)，但有减少的趋势。 3.烟酸促进巨噬泡沫细胞ABCA1、ABCG1的表达与对照组相比，0.25mM、0.5mM、1mM烟酸能够促进巨噬泡沫细胞ABCA1、ABCG1mRNA的表达，ABCA1的表达分别是对照组的3.7倍、18.1倍和34.4倍；ABCG1的表达分别是对照组的4.7倍、12.7倍和21.1倍，差异具有显著性(p<0.01或p<0.001)，这一作用存在明显的剂量—效应关系。 4.放线菌素D或DIDS阻断ABCA1、ABCG1mRNA及胆固醇外流的表达用5μg/ml放线菌素D或400μMDIDS与分别1mM烟酸共同培养巨噬泡沫细胞24h后，烟酸诱导巨噬泡沫细胞ABCA1、ABCG1mRNA明显降低，与对照组相比，差异具有显著性(p<0.001)。放线菌素D和DIDS还能抑制烟酸诱导的胆固醇外流，与对照组相比，差异具有显著性(p<0.001)。 5.烟酸促进巨噬泡沫细胞LXRα、PPARγmRNA的表达与对照组相比，0.25mM、0.5mM、1mM烟酸能够促进巨噬泡沫细胞LXRα、PPARγmRNA的表达，LXRα的表达分别是对照组的7.8倍、26.1倍和51.4倍；PPARγ的表达分别是对照组的9.7倍、41.1倍和75.3倍，差异具有显著性(p<0.05，p<0.01或p<0.001)，这一作用存在明显的剂量—效应关系。 6.GGPP和GW9662阻断ABCA1、ABCG1mRNA的表达和胆固醇的外流用10μMGGPP或GW9662与分别1mM烟酸共同培养巨噬泡沫细胞24h后，烟酸诱导巨噬泡沫ABCA1、ABCG1mRNA明显降低，与烟酸组相比，差异具有显著性(p<0.001)。GGPP和GW9662还能抑制烟酸诱导的胆固醇外流，与对照组相比，差异具有显著性(p<0.001)。 7.GW9662阻断LXRαmRNA的表达用10μMPPARγ抑制剂GW9662与1mM烟酸共同培养巨噬泡沫细胞24h后，烟酸诱导的LXRαmRNA明显降低，与烟酸组相比，差异具有显著性(p<0.001)。 结论: 1.烟酸能够显著促进巨噬泡沫细胞胆固醇外流，且存在明显的时间—效应关系和剂量—效应关系。 2.ABCA1和ABCG1在烟酸诱导的胆固醇外流中起到很重要的作用，烟酸对ABCA1和ABCG1的调控依赖于PPARγ—LXRα信号通路。