研究背景:肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,20世纪中期以来,在多数国家肺癌的发病率呈明显上升趋势,且逐年增高。肺癌可分为非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)两大类,其中非小细胞肺癌约占肺癌的80%。非小细胞肺癌患者的治疗仍以手术切除和放化疗综合治疗为主,临床证实疗效欠佳,患者的五年生存率仍低于20%。由于早期诊断不足及复发和转移等因素,致使肺癌患者预后不良。目前随着诊断方法的改进及靶向治疗药物的出现,肺癌患者生存期有所延长。然而,想大幅度地提高生存率,仍有赖于研究与肺癌发生和转移相关的基因或分子标记物,进而探讨肺癌发生、发展及转移的分子机制,解决肺癌的早期诊断、治疗及预后评估等重要的问题。TGF-β(transforming growth factor beta,转化生长因子 β)是一种多肽类细胞因子,已被证实在细胞的生长调节中起重要作用。作为TGF-β信号通路的主要成员之一,TGF-β1在正常生理条件下抑制上皮细胞的生长。值得注意的是,TGF-β1在肿瘤发生的过程中发挥着双重效应。在肿瘤发生的早期可作为肿瘤抑制因子抑制细胞增殖,促进细胞分化和诱导细胞凋亡。而在肿瘤的进展期TGF-β1转变成肿瘤的促进因子,通过免疫抑制或逃逸、促进血管生成和增加细胞外基质的产生来促进肿瘤的进展和转移。已有文献报道TGF-β1在乳腺癌、肝癌、胃癌和大肠癌中高表达,且患者的预后不良。尽管也有许多学者对TGF-β1在肺腺癌的表达和预后情况作出了研究和分析,但是在非小细胞肺癌的其他组织学类型如鳞癌和大细胞癌的表达和预后情况如何?以往对TGF-β1在肺癌中的表达研究多以定性分析为主,其定量表达特点如何?TGF-β 1的定量表达与非小细胞肺癌临床病理特征和预后关系又如何?目前未见文献回答这些问题。肺癌患者多死于侵袭、转移,因此深入地探讨肺癌侵袭转移的具体诱因和机制,从而人为抑制其侵袭作用已引起研究者广泛重视。目前大量研究认为上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)在肿瘤细胞的侵袭和远处转移过程中起有重要作用,已被证实在多种肿瘤EMT发生过程中,TGF-β1作为EMT的主要诱导剂,进而引起肿瘤侵袭转移。分子水平的相关研究发现:发生EMT的肿瘤细胞,上皮细胞标志E-cadherin表达减少或缺失,而间质细胞标志Vimentin却异常高表达。研究表明在肺腺癌细胞A549和PC9中,外源性TGF-β1诱导肿瘤细胞发生EMT过程,细胞在形态上转变成类似成纤维细胞或者肌纤维母细胞的表型,细胞间紧密连接破坏,细胞间隙增大。TGF-β1能够明显地抑制上皮标志E-cadherin的表达、促进间质标Vimentin的表达,使A549和PC9变得具有活动性,最终促进肿瘤的侵袭和转移。那么,与A549和PC9细胞同属肺腺癌细胞GLC-82,在外源性的TGF-β1刺激作用下,是否也能发生EMT过程并促进肿瘤的侵袭转移呢?为此我们进行了研究。此外,第10号染色体同源丢失磷酸酶-张力蛋白基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten,PTEN)是近年来被发现的一种具有磷酸脂酶活性的抑癌基因,作用于磷酸酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3)及蛋白底物局灶性黏附激酶(FAK),使其去磷酸化,调控丝、苏氨酸的功能,抑制PIP3及FAK信号通路的传导,从而诱导细胞凋亡,负性调节细胞生长并抑制肿瘤细胞的浸润和转移。目前已在多种肿瘤中发现PTEN基因突变的现象,丧失了对细胞生长的负性调控作用,从而导致肿瘤进行性生长。大量研究表明PTEN蛋白表达的缺失与肺癌发生发展有关,在胃癌、大肠癌、宫颈癌等肿瘤中TGF-β 1和PTEN存在相关关系,但报道观点不一,而两者在非小细胞肺癌组织中的定量表达特点及相关关系尚不清楚。综上所述,本课题拟从定量和半定量角度分析TGF-β 1蛋白在非小细胞肺癌组织中的表达特点和与临床病理特征之间的关系,探讨其在非小细胞肺癌中的预后意义,揭示TGF-β 1和PTEN在非小细胞肺癌组织中的定量表达特点及相关关系,试图阐明TGF-β 1诱导肺腺癌细胞GLC-82上皮间质转化及其与肿瘤侵袭性的关系。研究目的及内容:1、定量分析TGF-β1蛋白在非小细胞肺癌组织中表达特点,并探讨其在非小细胞肺癌中的预后意义;2、探讨TGF-β 1和PTEN在非小细胞肺癌组织中的定量表达特点及相关关系;3、初步探讨TGF-β 1诱导人肺腺癌细胞GLC-82上皮间质转化及其与侵袭的关系。材料和方法:1、TGF-β 1在正常肺组织和非小细胞肺癌组织中的表达及其预后意义分析采用免疫组化SP法检测24例正常成人肺组织和194例非小细胞肺癌组织中TGF-β 1蛋白的表达;用计算机ImageproPlus图像分析软件定量测试TGF-β1蛋白表达的阳性单位(Positive Unit,PU),定量分析不同类型肺组织中TGF-β1蛋白的表达情况,并分析其与非小细胞肺癌临床病理特征之间的关系。结合临床资料及随访资料对满足五年随访期的115例肺癌病人进行预后生存分析,探讨TGF-B 1能否作为判断非小细胞肺癌患者预后的独立危险因素。半定量结果的判断标准:根据染色程度和染色细胞所占百分比进行评分:阴性(无阳性着色)或弱阳性(+～++,细胞着色范围<30%)为低表达;中等强度阳性(++,细胞着色范围≥30%或者+++,细胞着色范围<50%)或者强阳性(+++,细胞着色范围>50%)为高表达。2、TGF-β1和PTEN在非小细胞肺癌组织中的定量表达及相关关系用免疫组化SP法检测110例非小细胞肺癌组织中TGF-β 1和PTEN蛋白的定量表达,定量分析二者分别与非小细胞肺癌患者临床病理特征之间的关系,并探讨在非小细胞肺癌中TGF-β 1和PTEN蛋白表达的相关性。3、TGF-β 1诱导人肺腺癌GLC-82细胞上皮间质转化及对体外侵袭的影响将GLC-82细胞分为空白对照组和实验组,空白对照组不做任何处理,实验组用5ng/ml的TGF-β1重重重组体处理48 h,相差倒置显微镜下观察细胞形态学变化;Western blot和QPCR检测EMT相关标记E-cadherin和Vimentin蛋白和基因的表达变化。采用Transwell实验检测各组细胞的迁移能力。探讨TGF-β1诱导肺腺癌细胞GLC-82发生上皮间质转化,进而促进细胞的侵袭转移能力,导致肺癌发生转移。4、统计学分析采用SPSS16.0软件进行统计学分析。多样本均数间的比较采用单因素方差分析,若方差齐,组间多重比较采用LSD法,若方差不齐,组间的多重比较采用Dunnett’s T3检验。两样本均数间的比较采用独立样本t检验,配对样本均数间的比较采用配对t样本。五年生存率的比较采用Pearson χ 2检验,利用Kaplan-Meier法进行单因素生存分析,差异显著性检验采用log rank检验,多因素生存分析采用Cox比例风险回归模型方法分析。双变量相关分析采用Spearman相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。结果:一、TGF-β 1在正常肺组织和非小细胞肺癌组织中的表达及其预后意义分析免疫组化和定量分析表明TGF-β 1在非小细胞肺癌组织和正常肺组织中的表达具有明显差异,非小细胞肺癌中TGF-β 1表达的PU值高于正常肺组织中的PU值,差异具有统计学意义(P = 0.000)。研究表明,TGF-β 1在非小细胞肺癌组织中的表达分别与TNM分期和淋巴结转移有关(P值均为0.000),分期Ⅲ-Ⅳ期患者的TGF-β 1蛋白的PU值(15.87±4.44)高于Ⅰ-Ⅱ期的患者(11.55±4.75);有淋巴结转移(15.05±4.60)患者TGF-β 1蛋白的PU值显著高于无淋巴结转移(10.58±4.50)的患者,而与患者的年龄、性别、吸烟史、分化级别、组织学类型和大体类型等临床病理特征无明显相关(P>0.05)。Kaplan-Meier生存分析显示在满足五年随访期的115例非小细胞肺癌患者中,其中有47例呈现TGF-β1低表达(40.8%),68例高表达(59.2%)。TGF-β 1蛋白高表达的患者的预后比TGF-β 1蛋白低表达的患者差(P=0.000,Log rank检验),有淋巴结转移的患者的预后比无淋巴结转移的患者差(P=0.000,Log rank检验),。COX风险比例回归模型的多因素分析结果表明TGF-β 1蛋白表达水平(RR = 2.565,P=0.002)和是否有淋巴结转移(RR = 1.874,P= 0.030)是影响非小细胞患者预后的独立因素。二、TGF-β 1和PTEN在非小细胞肺癌组织中的定量表达及相关关系分析TGF-β 1在非小细胞肺癌组织中的表达量高于正常肺组织,差异具有统计学意义(P=0.000),TGF-β1在非小细胞肺癌组织中的表达量与TNM分期以及是否有淋巴结相关(P值分别为0.000、0.002)。PTEN蛋白在非小细胞肺癌组织中的表达量明显低于正常肺组织(P =0.000),与肺癌的TNM分期有关(P=0.003),随着肺癌分期的进展,PTEN蛋白的表达量逐渐减弱。Spearman相关分析显示TGF-ββ 1和PTEN在非小细胞肺癌组织中的表达呈负相关(r =-0.380,P = 0.000)。三、TGF-β 1人诱导肺腺癌GLC-82细胞上皮间质转化及对体外侵袭的影响通过相差显微镜观察与空白对照组对比,在加入外源性重组体TGF-ββ 1的刺激后,细胞外形变长,变成梭形、纺锤形,细胞和细胞之间的连接变得松散,其细胞间隙略变大;Western blot和QRT-PCR显示实验组加入TGF-β1后下调了GCL-82细胞上皮标记E-cadherin蛋白和基因的表达,并增强间质标记Vimentin的表达;Transwell实验结果发现5ng/mlTGF-β 1处理的实验组细胞穿过小室的细胞数(68.20±5.49)与对照组比较明显增多(36.00±4.38)两者相比差异具有显著性(t=-13.920,P=0.000),说明TGF-β1处理的实验组细胞迁移能力与对照组相比显著增强。结论:1、TGF-β 1在非小细胞肺癌组织的表达水平与TNM分期和是否有淋巴结转移有关,其表达水平越高,患者的预后越差。COX多因素回归模型分析显示TGF-β1的表达水平和是否有淋巴结转移是影响非小细胞肺癌患者生存的独立预后因素,TGF-β1可能与肺癌发生有关,并且可作为非小细胞肺癌患者预后评估的一种生物标记。2、非小细胞肺癌组织中PTEN和TGF-β 1的表达呈负相关,TGF-β1的过表达可能导致PTEN的表达减少,促进非小细胞肺癌的发生发展,TGF-β 1和PTEN的联合检测可作为反映肺癌生物学行为的指标之一。3、TGF-B1诱导肺腺癌细胞GLC-82发生EMT,使其向间质细胞形态转化,进而增强肿瘤细胞的侵袭性,从而增加其侵袭、转移的能力。