最近的研究发现大鼠胰岛素启动子控制的 Cre重组酶系统（RIP-Cre）存在一些严重缺陷，即本应在胰岛 beta细胞中特异表达的 Cre重组酶也在许多胰腺外的组织特别是脑组织中表达。　　本研究的目的是找寻一种简单的方法以改善 RIP-Cre对胰岛 beta细胞特异性标记。为此利用实验室已构建成功的单质粒（pRIP-Cre-CMV-DsRed/LoxP2-EGFP）和双质粒（pRIP-Cre和pCMV-DsRed/LoxP2-EGFP）标记系统，瞬时转染胰岛素阳性的 INS-1细胞和一系列胰岛素阴性细胞，通过流式细胞术分析该系统标记 INS-1细胞的特异性。因此，如果标记系统具有特异性，胰岛素阳性细胞被标记为绿色，而胰岛素阴性细胞则为红色。　　本课题总共设计了如下实验以实现研究目的。　　第一组，将单质粒系统以一个浓度梯度转染细胞，发现该系统在48小时内可标记多达80％的INS-1细胞和约15%的Ad293细胞，且降低质粒浓度并不能完全消除非特异性标记。　　第二组，由于担心本实验使用的 RIP不具备应有的组织特异性，为此，利用pRIP-EGFP和pCMV-EGFP分别转染 INS-1和Ad293细胞，发现 pCMV-EGFP在 INS-1和Ad293细胞都观察到高比例的绿色信号；而 pRIP-EGFP只在INS-1细胞中观察到绿色信号。实验结果说明RIP具备很好的组织特异性。　　第三组，由于单质粒系统中RIP与组成型强启动子 CMV距离很近，可能产生启动子干扰现象并导致 RIP组织特异性降低。为此，使用pCMV-DsRed-RIP-EGFP质粒转染 INS-1和Ad293细胞，结果发现只有约0.1%的Ad293细胞产生绿色信号；增加质粒浓度并未增加在 Ad293细胞中的绿色信号。实验结果说明单质粒系统只存在微弱的启动子干扰现象。　　第四组，为直接检测启动子干扰作用对 RIP-Cre特异性的影响，本人使用双质粒系统转染细胞，48小时后发现约80%的INS-1细胞及10%左右的Ad293细胞可以被标记，这一结果与第一组实验的结果相似。　　第五组，考虑到 Cre重组酶的活性极高，有可能放大了 RIP的非组织特异性，因此，降低 Cre酶的表达水平将可提高 RIP-Cre系统的标记特异性。结果发现，通过利用核糖体内部进入位点（IRES）和蛋白快速降解肽段（d2）降低双质粒系统中Cre酶的表达水平后，INS-1和Ad293细胞中绿色阳性的比率都有所下降，但二者之间的比例提高了3-4倍。　　第六组，另一种途径是通过突变改造 Cre酶的活性。为此，本人构建了18个 Cre点突变体，并以双质粒系统转染细胞。发现所有 Cre突变体都导致在INS-1和Ad293细胞的重组率下降，但二者之间的比例上升高达15倍；尤其是Cre(K201R)和Cre(H289P)两个突变体导致 INS-1细胞中的重组率仅下降35%，而在不同物种和组织来源的胰岛素阴性 Ad293、CHO、HeLa、Pt67、SHG44和PC12细胞的重组率下降到可检测水平以下。　　第七组，为比较K201R和H289P突变体及野生型Cre酶的体外活性，本人构建了三个pCMV-Cre（WT、K201R和H289P）质粒，分别转染Ad293细胞，利用免疫柱层析技术纯化重组蛋白，并进行体外 DNA降解实验。发现无法测得 Cre(K201R)突变体的酶活，而 Cre(H289P)突变体的酶活约为 Cre野生型的3.5%左右。　　本研究通过两种途径提高了 RIP-Cre系统标记 INS-1胰岛 beta细胞的特异性，这对研究胰腺beta细胞发育与糖尿病的治疗具有重要意义。