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1型糖尿病(type 1 diabetes,T1D)是由T淋巴细胞介导,以选择性破坏胰岛β细胞为特征的器官特异性自身免疫性疾病[1]。胰岛β细胞存在着多种自身抗原,如胰岛素,谷氨酸脱羧酶(GAD),酪氨酸磷酸酶和锌转运体8(ZnT8)。其中,ZnT8被认为是T1D的重要自身抗原,Wenzlau等发现部分T1D高危患者发病前2年即可检测到ZnT8抗体且长期维持在较高水平[2,3]。我们前期研究发现ZnT8存在着多个抗原表位可被相应的自身抗体识别,且ZnT8抗体水平与T1D的发展存在着显著的相关性[4]。ZnT是一组将锌离子由胞内转运出胞外的跨膜蛋白,与锌铁调控蛋白(Zrt/Irt-like protein,ZIP)共同维护细胞内外锌离子的平衡[5]。2004年,Cheimienti等首次在ZnT家族中发现ZnT8蛋白,它由SLC30A8基因编码,高度特异的表达在胰腺中,后进一步研究发现ZnT8特异的表达在胰岛β细胞上,在INS-1细胞中过表达ZnT8可促使锌离子的聚集并增强糖刺激后的胰岛素释放[6,7]。这些研究表明ZnT8在胰岛素的合成和分泌中发挥重要作用。目前,动物来源的ZnT8全分子抗体在科研中已逐渐显示其重要应用价值,而关于人源ZnT8抗体的构建及应用暂无报道。检测ZnT8抗体和ZnT8特异性CD8+T细胞是预测和诊断T1D的重要手段。针对ZnT8靶点的特异性治疗将成为阻止T1D进展的潜在方法[81。因此,研发人源ZnT8抗体对T1D的临床诊断及治疗试剂的研发将具有重要的价值。通过单链抗体(scFv)噬菌体库展示技术构建全人源T1D scFv噬菌体抗体库,筛选ZnT8特异性scFv抗体,并对其功能进行鉴定,将为T1D的诊断及治疗试剂的研发提供新的基础及思路。研究方法1.原核表达重组人ZnT8蛋白以ZnT8(SLC30A8)基因为模板,扩增ZnT8氨基端(l-74aa)及羧基端(268-369aa)基因,重叠PCR制备氨基羧基融合基因(N/C);以JH5.2质粒(美国Babara实验室惠赠,该质粒含ZnT8羧基端(268-369aa)二聚突变体基因,第一个羧基端的325位为Arg,第二个羧基端的325位为Trp,两段基因通过一段柔性肽链接)为模板,扩增ZnT8(Arg325Trp)基因。两段目的基因酶切后分别与pcold Ⅱ连接,连接产物转化入Z.coli BL21感受态细胞获得阳性重组子,IPTG低温诱导表达后收集细胞沉淀,超声裂解沉淀后,上清用亲和柱纯化得到重组ZnT8蛋白,SDS-PAGE、Western blot 鉴定 ZnT8 重组蛋白。ELISA 检测 ZnT8(N/C)蛋白与商品化的多克隆ZnT8抗体结合的量效关系。2.构建全人源T1D scFv噬菌体抗体库取50位初诊T1D志愿者的外周血,采用放射免疫配体法检测ZnT8抗体水平,分离外周血单个核细胞(PBMC),提取细胞总RNA后逆转录为cDNA,通过人源scFv(single chain Fv fragment)抗体通用引物扩增重链及轻链可变区基因,再利用overlap-PCR法获得scFv基因;将scFv基因与pComb3XSS分别经SifI酶切,酶切产物连接后多次电转化入E.coli XL1-Blue感受态中,复苏细菌后加入辅助噬菌体VCSM13培养过夜,上清加入4%PEG8 000,3%NaCl,收集沉淀获得T1D scFv噬菌体抗体库。3.T1D自身抗原ZnT8特异性scFv抗体的筛选与表达以纯化的ZnT8(N/C)蛋白作为抗原,将制备好的scFv抗体库经过四轮“吸附—洗脱—扩增”,在最后一轮筛选得到的细菌集落中随机挑选单克隆,phage-ELISA鉴定后选择OD值较高的测序正确的克隆进达及纯化。4.T1D自身抗原ZnT8特异性scFv抗体的鉴定通过亲和力、Western Blot、ELISA、免疫组化方法等对纯化的scFv抗体进行特异性鉴定。研究结果1.将阳性重组质粒用pcoldⅡ测序引物进行PCR鉴定,ZnT8(N/C)基因扩增的片段大小为550 bp,ZnT8(Arg325Trp)基因扩增的片段大小为650bp,均与预期相符;将重组质粒转化入E.coli BL21,低温诱导表达后Western blot结果显示重组蛋白主要表达在细菌沉淀中。SDS-PAGE显示纯化后的ZnT8(N/C)蛋白分子量大小为20 kD,ZnT8(Arg325Trp)蛋白分子量大小为25 kD。ELISA结果表明ZnT8(N/C)蛋白能被商品化的ZnT8抗体识别,具有剂量依赖性,可以用于ZnT8抗体的筛选,其最适包被剂量为0.8μg/孔。2.两次PCR扩增后获得scFv基因(～750 bp),电转化入E.coli XL1-Blue感受态中,经辅助噬菌体感染后最终获得的全人源T1D scFv噬菌体抗体库的库容约为 1.0×108。3.经过四次筛选后,随机挑选160个克隆进行phage ELISA检测,结果表明11个克隆的OD值较高;测序后得到7株序列不同的scFv抗体。分别将其转化入E.coli Top1OF’感受态诱导表达,通过His亲和层析柱获得纯化的scFv抗体,SDS-PAGE结果显示其大小在25～35kD之间,且无杂蛋白条带,说明其纯度高。4.Phage ELISA检测中OD值最高的2株scFv抗体为C22及C27,对C22及C27进一步检测显示C22及C27与N/C融合蛋白的亲和力分别为5.953×10-8、5.397×10-8;Western Blot显示这两株抗体与ZnT8(N/C)蛋白具有特异的识别能力;ELISA结果显示这两株抗体与ZnT8(Arg325Trp)蛋白均有较好的结合能力;免疫组化结果显示这两株抗体均能够识别人胰岛β细胞。结论1.利用噬菌体展示技术成功构建了库容量为1.0×108的全人源T1D scFv噬菌体抗体库,为筛选T1D相关的自身抗体奠定了基础;2.筛选获得全人源ZnT8特异性scFv抗体7株,进一步鉴定其中的C22及C27两株抗体能够特异的识别人胰岛β细胞表达的ZnT8,为T1D的诊断及治疗试剂的研发提供了基础及思路。