淡水白鲳尾鳍细胞系的建立及低温诱导细胞凋亡的研究

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淡水白鲳属于喜温性鱼类,水温降至10℃时就出现寒害死亡。作者以淡水白鲳尾鳍组织为材料,植块培养法建立细胞系,命名为CBT。CBT细胞呈圆形或多边形,多为上皮样细胞,体积较大。核型分析表明,该细胞系的染色体数目是54条,为正常二倍体细胞。 本文以CBT细胞为研究对象,探讨了低温胁迫(10℃)对细胞的影响。实验应用Hoechst33258染色观察细胞形态变化;光学显微镜观察细胞骨架的改变:台盼兰、MTT法测定细胞活力;透射电子显微镜观察超微结构;激光扫描共聚焦显微镜检测磷脂酰丝氨酸(PS)外翻和线粒体膜电位的变化;流式细胞仪检测细胞凋亡亚峰;琼脂糖凝胶电泳观察DNA降解片段。实验结果表明,低温处理导致细胞收缩变圆,失去贴壁能力,伴随着张力纤维断裂破碎;随着低温处理时间的延长,细胞活力和线粒体膜电位显著下降(P<0.01);电镜下可见核质边聚现象,即染色质凝集成块靠近核膜,呈花瓣状、新月状或“8”字形:annexin-V-FITC/PI双染表明冷孵育可直接诱导细胞进入早期凋亡;流式细胞仪检测到10℃处理4d细胞凋亡率为23.04%。而晚期凋亡特征“DNA Ladder”和凋亡小体现象出现在复温阶段(冷孵育5~8d,32℃复温12h)。由此认为,冷胁迫淡水白鲳细胞致死的加04年浙江大学硕士学位论文途径是细胞凋亡,冷孵育可以直接诱导细胞进入早期凋亡,晚期凋亡现象必须经历复温阶段。同时,对冷诱导细胞凋亡机理的初步探讨表明,冷孵育后胞内氧化水平明显升高(P<0.01),抗氧化剂维生素E可以显著保护细胞。结果提示:冷诱导淡水白鳗CBT细胞凋亡可能是由活性氧(ROS)介导的。
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