【摘 要】
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研究背景及目的基孔肯雅热是基孔肯雅病毒感染所致,由白纹伊蚊和埃及伊蚊传播的一种虫媒传染病。我国早在1987年就报道了首例基孔肯雅热。迄今为止,世界上约有39%的人口居住在有基孔肯雅病毒流行的国家和地区,面临着被感染的风险。随着生态环境和气候条件的改变,全球气候变暖的趋势更加明显,埃及伊蚊和白蚊伊蚊活动范围逐渐扩大,国际经贸和文化的来往愈发频繁,基孔肯雅病毒在全球范围内的扩散速度越来越快,极有可能对
【基金项目】
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国家自然科学基金青年项目（No.81902097）:帕西乍罗样病毒对基孔肯雅病毒的复制传播抑制作用研究；
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研究背景及目的基孔肯雅热是基孔肯雅病毒感染所致,由白纹伊蚊和埃及伊蚊传播的一种虫媒传染病。我国早在1987年就报道了首例基孔肯雅热。迄今为止,世界上约有39%的人口居住在有基孔肯雅病毒流行的国家和地区,面临着被感染的风险。随着生态环境和气候条件的改变,全球气候变暖的趋势更加明显,埃及伊蚊和白蚊伊蚊活动范围逐渐扩大,国际经贸和文化的来往愈发频繁,基孔肯雅病毒在全球范围内的扩散速度越来越快,极有可能对更多新的国家和地区造成威胁。但目前,基孔肯雅病毒感染细胞的受体尚未阐明,感染后所致关节症状的致病机制不甚清楚,同时针对基孔肯雅热仍没有特异的药物和疫苗。因此,本研究拟通过分析基孔肯雅病毒感染前后钙蛋白酶-2的表达差异及其活性变化,同时通过抑制钙蛋白酶-2的表达和活性水平,确定钙蛋白酶-2是否能影响基孔肯雅病毒的复制,探索其作用机制,以期能够为探究基孔肯雅病毒的致病机制打下理论基础,为基孔肯雅热的防控和治疗提供科学依据。研究方法1.将基孔肯雅病毒分别感染细胞和小鼠,通过实时荧光定量PCR和钙蛋白酶活性检测试剂盒,分别检测细胞和小鼠内钙蛋白酶-2的表达和活性水平。2.用基孔肯雅病毒感染经抑制剂inhibitor Ⅲ作用后的Hela细胞,通过实时荧光定量PCR和空斑形成实验,分别检测细胞内基孔肯雅病毒E1基因的表达量和细胞上清内基孔肯雅病毒的滴度。3.用基孔肯雅病毒感染已转染钙蛋白酶-2特异性小干扰RNA的Hela细胞,通过实时荧光定量PCR和空斑形成实验,分别检测细胞内基孔肯雅病毒的表达量和细胞上清内基孔肯雅病毒的滴度。4.用基孔肯雅病毒感染经抑制剂inhibitor Ⅲ和钙蛋白酶-2特异性小干扰RNA作用的Hela细胞,通过蛋白印迹实验分别检测细胞内波形蛋白和微管蛋白的表达水平。5.用基孔肯雅病毒感染经抑制剂inhibitor Ⅲ作用后的Hela细胞,通过免疫荧光技术分别观察细胞内波形蛋白和微管蛋白的分布情况。研究结果1.基孔肯雅病毒的感染对细胞以及小鼠关节、肌肉组织内钙蛋白酶-2的表达和活性无显著影响。2.钙蛋白酶-2的活性抑制剂inhibitor Ⅲ作用后,能显著降低Hela细胞内基孔肯雅病毒的复制水平和细胞上清中基孔肯雅病毒的滴度。3.钙蛋白酶-2特异性小干扰RNA沉默钙蛋白酶-2基因的表达后,能显著降低Hela细胞内基孔肯雅病毒的复制水平和细胞上清中基孔肯雅病毒的滴度。4.钙蛋白酶-2的活性抑制剂inhibitor Ⅲ和特异性小干扰RNA对Hela细胞内波形蛋白和微管蛋白的表达水平无显著影响。5.基孔肯雅病毒感染Hela细胞后,波形蛋白出现绕细胞核收紧聚拢的重排现象,且钙蛋白酶-2的活性抑制剂inhibitor Ⅲ能够抑制此现象。6.基孔肯雅病毒感染Hela细胞后,微管蛋白边缘出现轻微的绕细胞核收拢现象,但钙蛋白酶-2的活性抑制剂inhibitor Ⅲ对此现象没有明显的影响。结论本研究发现,基孔肯雅病毒感染对钙蛋白酶-2的表达和活性无显著影响,但钙蛋白酶-2的活性抑制剂inhibitor Ⅲ和特异性小干扰RNA能显著抑制Hela细胞内基孔肯雅病毒的复制和细胞上清中的病毒滴度,表明钙蛋白酶-2对于基孔肯雅病毒的复制至关重要。同时,钙蛋白酶-2的活性抑制剂inhibitor Ⅲ和特异性小干扰RNA对细胞内波形蛋白和微管蛋白的表达水平没有明显影响。除此之外,钙蛋白酶-2的活性抑制剂inhibitor Ⅲ对细胞内微管蛋白轻微地向细胞核收紧的现象没有明显影响,但可以抑制细胞内波形蛋白因基孔肯雅病毒感染而出现的绕细胞核聚拢的重排现象,这可能是钙蛋白酶-2影响基孔肯雅病毒复制的机制之一,对于理解基孔肯雅病毒复制的生物学意义以及抗病毒策略的未来发展至关重要。
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