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丙谷二肽(L-Alanyl-L-glutamine,Ala-Gln)具有溶解度高、热稳定性好及分解速率快等优势,已经成为一种替代谷氨酰胺(L-Glutamine,Gln)的新型营养补充剂,被广泛应用于食品、保健品和医药等领域。α-氨基酸酯酰基转移酶(α-amino acid ester acyl transferase,Aet)能以丙氨酸甲酯盐酸盐(L-alanine methyl ester hydrochloride,AlaOMe)和Gln为底物直接合成Ala-Gln,基于表达Aet的微生物合成法因其原料廉价易得、反应步骤少、反应条件温和、环境污染小且副产物少,可以作为工业化生产Ala-Gln的新方法。然而,Aet催化合成Ala-Gln过程存在反应时间长和底物转化率低等问题,限制了其在Ala-Gln工业化生产中的应用。本论文的研究工作构建了异源表达Sphingobacterium siyangensis来源Aet(SsAet)的重组大肠杆菌和重组酿酒酵母,通过菌体的重复利用及絮凝自固定化技术,解决了上述问题,为实现Ala-Gln安全、绿色且高效生产奠定了基础。取得的主要研究结果如下:首先,构建异源表达SsAet的重组大肠杆菌高效合成Ala-Gln。以最常用的表达型宿主 BL21(DE3),构建了重组大肠杆菌 BL21(DE3)-pET29a-SsAET(BPA),发现 BPA表达了大量的包涵体,影响了其催化活性。通过更换有助于蛋白二硫键形成的宿主,提高蛋白的溶解性,其中Origami 2(DE3)-pET29a-SsAET(OPA)的SsAet可溶表达量最高,且催化活性是BPA的1.4倍。进一步优化了 OPA的诱导条件和全细胞催化合成Ala-Gln的反应条件,确定了最佳的诱导条件:温度16℃、诱导OD620=0.25、诱导时间12h及IPTG浓度0.6 mmol/L;最佳的反应条件:温度25℃、pH值8.5、反应溶液硼酸盐缓冲液及底物摩尔配比AlaOMe/Gln=1/2。在最优条件下,以OPA作为合成Ala-Gln的全细胞催化剂,反应过程最短可在5 min内完成,获得最高的底物转化率为94%,而比生产强度可高达1.78 g/L·min-1·OD620-1,是目前国内外文献中报道的最高水平。除此之外,OPA具有良好的重复利用性,经五个循环批次反应仍能维持80%以上的催化活性,实现了循环高效合成Ala-Gln。但是,在相同的细胞浓度和反应时间内,OPA全细胞的催化效率比裂解液降低了 21%,发现了物质扩散阻力的存在。其次,构建表面展示SsAet的重组酿酒酵母。为了克服物质扩散阻力和大肠杆菌表达系统潜在的生物安全问题,以生物安全性的酿酒酵母作为表达宿主,将SsAet以N端和C端锚定两种方式展示在酵母细胞表面,通过免疫荧光实验,证明了 SsAet已成功固定在酵母细胞壁上;综合比较菌株生长情况和催化活性,选择N端锚定作为SsAet在酵母表面展示的方法。在此基础上,通过密码子优化提高了 SsAet表达量,发现经密码子优化的EBY100-pYD1-SsAETs(EPagaAs)在20 min时Ala-Gln合成量是未经密码子优化菌株的1.7倍;反应终点从40 min缩短至30 min,生产效率提高了 33%。但是,EPagaAs合成Ala-Gln的反应时间长,且底物转化率仅为OPA的58%,推测酵母表达系统中蛋白翻译后修饰可能影响了 SsAet的催化活性。然后,针对上述问题,研究了蛋白翻译后修饰对SsAet的影响。以糖基化程度低的毕赤酵母为表达宿主,通过密码子优化,提高蛋白表达量和催化效率,构建了分泌表达SsAet的重组毕赤酵母GS115-pPIC9-SsAETP(GPAP)。以GPAP为研究对象,对重组毕赤酵母的诱导条件和合成Ala-Gln的反应条件进行了优化,确定了最佳的诱导温度为26℃、诱导时间为3d及甲醇补加量(v/v)为1.5%;最佳的反应温度为28℃、反应pH值为8.5、反应底物为AlaOMe及底物摩尔配比AlaOMe/Gln为2/1。在最优条件下,GPAP的底物转化率仅为OPA的71%左右,再次验证了蛋白后修饰作用对SsAet催化活性的影响。在此基础上,构建了胞内和分泌表达SsAet的重组毕赤酵母,发现胞内表达SsAet重组菌株的催化活性明显高于分泌表达的,其中胞内表达且去掉内源信号肽的菌株KM71-pPIC3.5K-SAETP1800(KP3.5KAP1800)合成Ala-Gln的底物转化率最高为80%,能达到OPA的90%左右,比分泌表达的对比菌株提高了 41%,阐述了胞内表达SsAet和去掉内源信号肽是提高酵母表达系统中SsAet催化活性的有效方法。通过SDS-PAGE和Western blotting发现了分泌型SsAet分子量的增加;通过去糖基化酶的切除,证明了分泌型SsAet中糖基化修饰的存在;通过LC-MS证明了糖基化修饰发生在第442位Asn残基上;通过圆二色光谱仪鉴定了胞内和分泌型SsAet的二级结构,发现了两者的显著性差异,证明了糖基化修饰是影响SsAet结构和催化活性的重要因素。最后,基于上述研究结果,构建了自固定化重组酿酒酵母高效合成Ala-Gln。使用高拷贝数质粒构建了胞内表达SsAet且去掉内源信号肽的EBY100-pRS424-SsAETs1800(EP424AS1800)。通过培养和反应条件的优化,EP424AS1800能在5 min内获得高达74%的底物转化率,是表面展示重组菌EPagaAs的1.44倍,能达到OPA的83%以上;反应时间比EPagaAs缩短了 80%以上,生产效率提高了 5倍;比生产强度高达1.28 g/L·min·1·OD600-1。通过导入絮凝基因FLOI,得到了毫米级絮凝颗粒且催化活性不受影响的EP424As1800-FLOI,实现了其在反应器内的自固定化。EP424AS1800-FLO1经过十次循环催化反应后仍能保持稳定的催化活性,实现了连续高效合成Ala-Gln。本论文的研究为Ala-Gln安全、绿色且高效的工业化生产奠定了基础。