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粪肠球菌(Enterococcus faecalis)作为临床感染中最常见的致病菌，由于其固有性耐药和获得性耐药，已经对多种传统的抗生素产生了耐药性，因此新型抗生素的研发迫在眉睫。抗菌肽作为一种新型的抗菌药物出现在人类的视线中，抗菌肽是天然免疫的重要组成部分，是一类由生物体特定基因编码的具有生物活性的多肽，具有广谱的抗菌活性，其独特的杀菌机理使细菌不易产生耐药性，因此抗菌肽是目前最有应用前景的新型抗生素。本实验室前期以富含赖氨酸/亮氨酸的中国林蛙皮肤抗菌肽LK-6为模板，通过不同位置的色氨酸替换，设计合成了7种含色氨酸系列抗菌肽。本文主要研究了含色氨酸系列抗菌肽对临床分离的多药耐药粪肠球菌(Multiple-drug resistant Enterococcus faecalis, MREF)的抗菌作用，为抗菌肽抗多药耐药菌的侵袭和感染提供理论基础。
抗菌实验结果表明：7个含色氨酸的抗菌肽对MREF都有较高的抗菌活性，其中I4W抗菌活性最好，MIC值为1.56μМ，L12W的MIC值为6.25μМ，是I4W的4倍，其余几种的MIC值均为3.13μМ。抗菌肽I4W和L5W的杀菌动力学实验表明：随着肽浓度的增加和肽作用时间的延长，存活的细菌数逐渐减少，说明含色氨酸系列抗菌肽I4W和L5W的杀菌活性具有浓度依赖和时间依赖性，其中I4W的杀菌效果较好，I4W在浓度为16×MIC时，作用180min后能将MREF全部杀死，而L5W需要在浓度为16×MIC时，作用240min后，才能将MREF全部杀死，比I4W多了60min。扫描电镜观察到加入含色氨酸系列抗菌肽I4W和L5W后，MREF细胞形态发生了明显变化，I4W和L5W的浓度为1×MIC时，细菌之间发生黏连；当肽浓度增加到2×MIC时，细菌严重变形并产生突起，内容物发生泄漏，甚至死亡。
采用Zeta电势实验以及细胞膜和细胞外膜通透性实验检测含色氨酸系列抗菌肽对MREF细胞膜系统的影响。结果显示：带正电荷的含色氨酸系列抗菌肽I4W和L5W首先通过静电作用与带负电荷的MREF外膜结合，当肽浓度为2×MIC时，能完全中和MREF细菌外膜负电荷；抗菌肽I4W和L5W能增加细菌细胞外膜的通透性，并随着肽浓度增大，外膜渗透性增强，当I4W和L5W浓度增加到25μМ时，外膜渗透性均达到最大。不仅如此，我们的研究发现I4W和L5W对MREF的细胞膜的通透性也有影响，浓度为4×MIC的I4W和L5W对MREF细胞膜的去极化程度分别增加了2倍和1.5倍，但与阳性对照多粘菌素相比，对细胞膜去极化的程度较低。我们又合成了MREF模拟膜，进一步研究I4W和L5W对细胞膜的通透性的影响，结果表明：当I4W和L5W的浓度达到4×MIC时，模拟膜内钙黄绿素释放量分别达到50%和40%，说明高浓度的I4W和L5W对MREF细胞膜具有明显的破坏作用。用激光共聚焦显微镜观察的结果进一步证明了I4W和L5W对细胞膜的破坏，浓度为4×MIC的I4W和L5W处理MREF细胞1小时，细菌中红色荧光值分别增加了97%和91%，绿色荧光值降低了89%和83%，说明I4W和L5W破坏了细胞膜的完整性。
利用结晶紫染色法、苯酚硫酸法和RT-qPCR等实验方法检测了含色氨酸系列抗菌肽对生物被膜(Biofilm)的影响。结果显示：含色氨酸系列抗菌肽I4W和L5W首先通过抑制毒性因子明胶酶相关基因fsrA、fsrB、fsrC的表达，抑制毒性因子明胶酶(GelE)基因的表达，导致明胶酶活性降低，无法激活细菌表面的自溶素的释放，使自溶素活性降低，进而抑制了Biofilm组分EPS和eDNA的生成，最终抑制Biofilm的形成。其中I4W具有更好的抑制效果，浓度为1/4×MIC时，对GelE基因的表达量的抑制率为27.6%，对明胶酶活性、自溶素活性的抑制率达到15.6%和37.1%，eDNA的生成量减少了8.6%，而当浓度增加到1×MIC时，对两种毒性因子活性的抑制率提高到了53.2%和57.5%，eDNA的生成量达到最低，说明I4W抑制Biofilm的形成是浓度依赖的。含色氨酸系列抗菌肽I4W和L5W对Biofilm也有分解作用，并且浓度越大分解的效果越好，MBIC50和MBRC50值显示I4W和L5W对Biofilm形成的抑制作用要好于分解作用。以上实验结果提示含色氨酸系列抗菌肽能够通过抑制群体感应系统中的fsr系统，降低毒性因子明胶酶的活性，进而抑制Biofilm的生成。
含色氨酸系列抗菌肽I4W和L5W对人结肠癌细胞Caco-2和人巨噬细胞THP-1内的细菌也具有抗菌活性。细胞内的抗菌结果显示：抗菌肽I4W和L5W具有较强的胞内抗菌能力，当I4W和L5W浓度为1×MIC时，Caco-2细胞内MREF存活率分别为57.3%和65.6%，THP-1细胞内MREF存活率分别为34.5%和47.9%；当肽浓度增大到4×MIC时，Caco-2细胞内MREF存活率分别减少到11.8%和18.7%，THP-1细胞内MREF存活率分别减少到1.5%和4.7%，证明含色氨酸系列抗菌肽I4W和L5W可以杀死细胞内的MREF。此外，I4W和L5W能够减低THP-1细胞炎症因子TNF-α和IL-6的生成，进而抑制炎症的产生。
抗菌实验结果表明：7个含色氨酸的抗菌肽对MREF都有较高的抗菌活性，其中I4W抗菌活性最好，MIC值为1.56μМ，L12W的MIC值为6.25μМ，是I4W的4倍，其余几种的MIC值均为3.13μМ。抗菌肽I4W和L5W的杀菌动力学实验表明：随着肽浓度的增加和肽作用时间的延长，存活的细菌数逐渐减少，说明含色氨酸系列抗菌肽I4W和L5W的杀菌活性具有浓度依赖和时间依赖性，其中I4W的杀菌效果较好，I4W在浓度为16×MIC时，作用180min后能将MREF全部杀死，而L5W需要在浓度为16×MIC时，作用240min后，才能将MREF全部杀死，比I4W多了60min。扫描电镜观察到加入含色氨酸系列抗菌肽I4W和L5W后，MREF细胞形态发生了明显变化，I4W和L5W的浓度为1×MIC时，细菌之间发生黏连；当肽浓度增加到2×MIC时，细菌严重变形并产生突起，内容物发生泄漏，甚至死亡。
采用Zeta电势实验以及细胞膜和细胞外膜通透性实验检测含色氨酸系列抗菌肽对MREF细胞膜系统的影响。结果显示：带正电荷的含色氨酸系列抗菌肽I4W和L5W首先通过静电作用与带负电荷的MREF外膜结合，当肽浓度为2×MIC时，能完全中和MREF细菌外膜负电荷；抗菌肽I4W和L5W能增加细菌细胞外膜的通透性，并随着肽浓度增大，外膜渗透性增强，当I4W和L5W浓度增加到25μМ时，外膜渗透性均达到最大。不仅如此，我们的研究发现I4W和L5W对MREF的细胞膜的通透性也有影响，浓度为4×MIC的I4W和L5W对MREF细胞膜的去极化程度分别增加了2倍和1.5倍，但与阳性对照多粘菌素相比，对细胞膜去极化的程度较低。我们又合成了MREF模拟膜，进一步研究I4W和L5W对细胞膜的通透性的影响，结果表明：当I4W和L5W的浓度达到4×MIC时，模拟膜内钙黄绿素释放量分别达到50%和40%，说明高浓度的I4W和L5W对MREF细胞膜具有明显的破坏作用。用激光共聚焦显微镜观察的结果进一步证明了I4W和L5W对细胞膜的破坏，浓度为4×MIC的I4W和L5W处理MREF细胞1小时，细菌中红色荧光值分别增加了97%和91%，绿色荧光值降低了89%和83%，说明I4W和L5W破坏了细胞膜的完整性。
利用结晶紫染色法、苯酚硫酸法和RT-qPCR等实验方法检测了含色氨酸系列抗菌肽对生物被膜(Biofilm)的影响。结果显示：含色氨酸系列抗菌肽I4W和L5W首先通过抑制毒性因子明胶酶相关基因fsrA、fsrB、fsrC的表达，抑制毒性因子明胶酶(GelE)基因的表达，导致明胶酶活性降低，无法激活细菌表面的自溶素的释放，使自溶素活性降低，进而抑制了Biofilm组分EPS和eDNA的生成，最终抑制Biofilm的形成。其中I4W具有更好的抑制效果，浓度为1/4×MIC时，对GelE基因的表达量的抑制率为27.6%，对明胶酶活性、自溶素活性的抑制率达到15.6%和37.1%，eDNA的生成量减少了8.6%，而当浓度增加到1×MIC时，对两种毒性因子活性的抑制率提高到了53.2%和57.5%，eDNA的生成量达到最低，说明I4W抑制Biofilm的形成是浓度依赖的。含色氨酸系列抗菌肽I4W和L5W对Biofilm也有分解作用，并且浓度越大分解的效果越好，MBIC50和MBRC50值显示I4W和L5W对Biofilm形成的抑制作用要好于分解作用。以上实验结果提示含色氨酸系列抗菌肽能够通过抑制群体感应系统中的fsr系统，降低毒性因子明胶酶的活性，进而抑制Biofilm的生成。
含色氨酸系列抗菌肽I4W和L5W对人结肠癌细胞Caco-2和人巨噬细胞THP-1内的细菌也具有抗菌活性。细胞内的抗菌结果显示：抗菌肽I4W和L5W具有较强的胞内抗菌能力，当I4W和L5W浓度为1×MIC时，Caco-2细胞内MREF存活率分别为57.3%和65.6%，THP-1细胞内MREF存活率分别为34.5%和47.9%；当肽浓度增大到4×MIC时，Caco-2细胞内MREF存活率分别减少到11.8%和18.7%，THP-1细胞内MREF存活率分别减少到1.5%和4.7%，证明含色氨酸系列抗菌肽I4W和L5W可以杀死细胞内的MREF。此外，I4W和L5W能够减低THP-1细胞炎症因子TNF-α和IL-6的生成，进而抑制炎症的产生。