面神经为混合神经,以运动功能为主。从中枢到末梢之间的任何部位受损,皆可导致部分性或完全性面瘫,引起患者面部肌肉萎缩和颌面部畸形,影响患者身心健康及生活质量。周围性面神经缺损后的再生和功能恢复一直是整形外科、颌面外科、神经外科迫切需要解决的难题,是当今显微外科学、创伤外科学、细胞生物学、分子生物学、组织工程学等学科重要的研究领域。自体神经移植修复的方法由于存在来源受限和牺牲供区感觉功能的问题,不能满足长段神经缺损修复的需要。本实验采用低渗、反复冻融及NaOH溶解的联合使用的方法制备脱细胞神经移植物(Acellular nerve scaffold,ANS),并对其进行生物学评价,进一步证实其具有较弱的抗原性,为逐步向临床应用过渡打下基础。本论文针对猪来源于ANS,按照GB/T16886《医疗器械生物学评价》进行了生物学评价,验证异种ANS的生物安全性,并且对ANS在体内引起免疫反应进行相应的实验研究,实验分为以下五个部分:实验一应用两种方法制备脱细胞神经支架及其生物相容性为获取生物相容性良好的异种ANS,取健康约克猪肋间神经长约100mm和SD大鼠坐骨神经30根,比较低渗、反复冻融及NaOH溶解的联合使用的方法和传统的化学制备方法,即Sondell法制备ANS,利用光、电镜观察其结构特征,结果显示两种方法在清除神经免疫原性物质的同时,联合使用的方法较好地保存了神经支架三维网管状结构,可能成为自体神经移植的替代材料。并且分别对两种方法制备的ANS进行生物相容性的评价,参考国家标准GB/T16886《医疗器械生物学评价》的一系列指标,包括第4部分:与血液相互作用;实验第5部分:体外法细胞毒性实验;第6部分:植入后局部反应实验;溶血实验和细胞毒性实验结果发现两种方法制备的ANS,对细胞增殖无差异。而植入后局部反应实验发现联合方法制备脱细胞神经支架植入SD大鼠皮下,4周炎性细胞基本消退,而Sondell法制备ANS,4周后局部仍有少量炎性细胞。实验二三种消毒方式处理脱细胞神经支架的生物相容性取新鲜York猪神经,应用低渗、反复冻融及NaOH溶解的联合使用的方法,分别应Co60、ETO和0.1% PAA三种消毒方法处理;通过观察不同实验组ANS的细胞毒性、体外胶原酶敏感性实验、细胞相容性实验和植入后局部反应实验,评价应用不同消毒方法对ANS的生物相容性的影响。结果证实应用PAA消毒有效并且便利,经PAA处理的ANS有良好的细胞、组织相容性和生物安全性,所以应用PAA是消毒ANS的理想方法。实验三异种脱细胞神经支架靶抗原的实验研究研究人血清对猪天然神经组织和ANS结合情况及支架内a-半乳糖残基(a-Gal)的分布。方法:制备ANS分别以人血浆及BSI-B4为一抗或亲和物,用亲和免疫组织化学方法观察各型人血浆对上述各组织的结合和组织内a-Gal的分布情况。并用a-半乳糖基酶(a-GT)消化后,重复上述实验。应用结果表现为血浆与被测天然神经结合,主要分布在神经束膜和外膜上。BSI-B4与血清结合的部位相似。经a-GT消化后,人血清和BSI-B4与两种猪组织的结合反应除少数部位存在差异外,反应消失。脱细胞神经支架未见血清及BSI-B4结合。实验四定量检测脱细胞神经支架中残余DNA不同方法制备的ANS在去除神经组织中细胞成分的效果存在很大差别,残余的细胞膜抗原、异种细胞中的DNA和破坏相关分子模式(DAMP)都引起不利的免疫反应。本实验应用斑点印记杂交法检测DNA残余,结果显示脱细胞神经支架中的残余DNA是21.1+0.7 pg /mg实验五脱细胞神经支架引起的Th2限制性的免疫应答的实验研究将异种ANS和异种天然神经植入C57小鼠皮下,切除植入部位的皮肤、移植物和皮下肌肉组织,应用RT-PCR检测植入部位局部的细胞因子表达;取C57小鼠外周血,应用ELISA检测全身的特异性抗体表达,结果显示移植异种ANS 4周后,移植的局部IL-4表达较强,缺少INF-r表达。对外周血中特异性抗体表达检测,结果显示IgG1出现表达较强,而IgG2a和IgG2b表达较弱。