研究目的丹参酮Ⅱ A联合三氧化二砷作用于NB4细胞移植瘤裸鼠,观察药物处理移植瘤裸鼠一定时间后的作用效果及对PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响以及对Caspase-3和Bax蛋白表达的影响,了解药物作用的具体机制,为丹参酮ⅡA用于治疗或辅助治疗急性早幼粒细胞白血病提供依据。研究方法1.NB4细胞的培养：将细胞培养在由10%胎牛血清+90% RPMI-1640(含双抗)组成的培养基中,培养箱环境为：37℃、5%CO2饱和度,每2-3天换液传代一次,实验所用细胞均为对数生长期细胞。2.采用皮下接种法构建NB4细胞移植瘤裸鼠动物模型,移植瘤裸鼠通过随机的方法分为4组,对照组、30mg/kg Tan ⅡA组、5mg/kg ATO组、联合用药组(30mg/kg Tan ⅡA+5mg/kg ATO),采用剪耳法标记裸鼠,于接种后第2天开始给药,均为腹腔注射,连续给药14天。3.给药期间密切观察裸鼠成瘤时间,肿瘤生长特点,用游标卡尺每2天测量NB4细胞移植瘤的最大长径(a)和最小短径(b),根据移植瘤体积计算公式：体积=ab2/2,计算移植瘤体积,绘制肿瘤生长曲线,测量移植瘤的重量,根据公式：抑瘤率=(M对照组-M实验组)/M对照组×100%,计算药物抑瘤率。4.移植瘤裸鼠处死后,立即剥离移植瘤组织备用,同时取裸鼠的肝、脾、双肾及淋巴结组织做HE染色,观察肝、脾、肾脏及淋巴结结构是否完整、有无肿瘤细胞转移。5.采用RT-PCR法检测各组肿瘤组织mTOR、AKT mRNA的表达水平,运用专业分析系统ImageJ对RT-PCR条带光密度进行分析,计算特异目的基因与相应内参表达水平比值。采用免疫组织化学法检测各组肿瘤组织Caspase-3、Bax的表达水平,计数一定量的细胞,根据阳性细胞占的百分比和细胞染色强弱程度进行综合评分,在此次试验中将(+、++、+++)均归类为蛋白表达阳性,无分级差别。结果1.移植瘤成瘤时间及生长特点将对数生长期的NB4细胞(约4×106个/只,调整体积为0.2m1)接种于裸鼠左肩甲部皮下,于接种后第7±2天24只裸鼠全部成瘤,出现肉眼可见的瘤块,成瘤率100%,成瘤后皮下瘤块生长迅速。2.随着给药时间延长,不同组移植瘤体积增长速度不同,移植瘤增长速度对照组>Tan ⅡA组>ATO组>联合用药组,其不同组随着给药时间的推移移植瘤的生长曲线如图2,用药14天后的24小时内处死裸鼠,测量移植瘤的质量,对照组、Tan ⅡA组、ATO组、联合用药组移植瘤的质量分别为2.82±0.38g、2.68±0.47g、2.38±0.36g、2.12+0.21g,单因素方差分析显示不同组移植瘤平均质量差异有统计学意义,Tan ⅡA组、ATO组、联合用药组抑瘤率分别为4.94%、15.74%、24.80%。3.移植瘤裸鼠淋巴结、肝脏、脾脏、肾脏结构完整,体积大小无明显差异,HE染色发现裸鼠上述组织无病理改变,未见NB4细胞转移。4.采用RT-PCR法检测mTOR、AKT mRNA表达结果显示：对照组、Tan ⅡA组、ATO组、联合用药组mTOR mRNA的相对表达值分别为0.907±0.059、0.883±0.070、0.821±0.039、0.643±0.103, AKT mRNA的相对表达值分别为0.872±0.075、0.839±0.071、0.776±0.054、0.705±0.060。5.采用免疫组织化学法法检测Caspase-3、Bax的表达结果显示：对照组、Tan ⅡA组、ATO组、联合用药组caspase-3阳性表达数分别为3(16.7%)、4(22.2%)、9(50.0%)、13(72.2%),Bax阳性表达数分别为4(22.2%)、7(38.9%)、12(66.7%)、16(88.9%)。结论ATO、Tan ⅡA联合ATO可抑制移植瘤的生长,Tan ⅡA联合ATO用药作用显著；Tan ⅡA联合ATO可抑制mTOR、AKT mRNA的表达；Tan ⅡA联合ATO通过上调Caspase-3、Bax蛋白的表达诱导细胞凋亡。