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研究背景传统产前遗传学诊断获取胎儿DNA的侵入性方法存在一定的感染或流产的风险。经宫颈获取的胎盘脱落的滋养层细胞具有完整的胎儿基因组信息,此方法不受孕妇年龄、孕周、产次、体重等因素的影响,从而成为近年来无创产前检测的研究热点。已有研究利用经宫颈获取的细胞（transcervical cell,TCC）样本中分离的滋养层细胞检测常见的胎儿染色体非整倍体、通过测序分析诊断脊髓性肌萎缩和囊性纤维化等单基因病。但TCC样本中存在大量的母源细胞背景,对TCC样本中滋养层细胞进行有效分离是进行下游检测分析的重要前提,但目前仍缺乏快速、有效且重复性高的方法。近年来单基因病无创产前检测技术有了飞速发展,对于TCC样本中分离的滋养层细胞进行单基因遗传病检测的研究尚属于探索阶段,仍有许多难点。研究目的本研究的主要目的有以下三个方面:（1）建立快速有效、重复性好的TCC样本滋养层细胞富集方法,为下游检测分析提供足量的细胞;（2）建立对富集分离的脱落滋养层细胞的胎儿源性鉴定方法,为下游检测分析奠定重要基础;（3）以富集分离的脱落滋养层细胞为材料,探索基于胎儿源性细胞的单基因遗传病无创产前检测的可行性。方法（1）查阅既往文献报道的女性生殖道细胞表面标记物,通过流式染色鉴定其在宫颈上皮细胞系、JEG3细胞系及TCC样本的表达情况,筛选母源细胞特异标志物。（2）通过RNA-seq技术对宫颈上皮细胞系、JEG3细胞系进行高通量测序分析,以转录组学测序分析结果为基础,综合差异表达基因组间差异倍数、具有的功能,我们按照细胞膜表达、表达丰度相对高、有商品化抗体的原则,初步筛选有潜力的宫颈上皮细胞标志物,经流式染色筛选特异标志物。（3）基于筛选的母源细胞特异标志物及绒毛外滋养层细胞（extravillous trophoblast,EVT）特异标志物HLA-G建立基于负筛+正筛的单克隆抗体的磁激活细胞分选法（combining negative and positive selection,CNPS）,利用JEG3细胞系+TCT掺入样本初步鉴定CNPS的富集效率。（4）收集3例正常单胎妊娠男胎孕妇的TCC样本,经CNPS富集后的候选EVT细胞经流式单细胞分选,然后将分选得到的所有单细胞进行全基因组扩增（whole genome amplification,WGA）,对WGA产物进行低覆盖度测序分析,根据测序结果鉴定男性胎儿源性细胞。（5）将低覆盖度测序分析为高质量的胎儿源性EVT细胞及脐血gDNA进行深度全基因组测序（whole genome sequencing,WGS）,评估其在全基因组水平上的覆盖度、单核苷酸变异（single nucleotide variant,SNV）、插入缺失（insertion and deletion,InDel）变异的检测能力,探讨其单基因遗传病无创产前检测的可能性。结果（1）流式结果显示白细胞表面共同抗原CD45在宫颈上皮细胞系、JEG3细胞系表面的表达为0.01%、0.0%,在TCC样本中的表达为13.1%。而Syndecan-1、ER、PR在HcerEpic宫颈上皮细胞系、JEG3细胞系均有表达。因此纳入CD45作为TCC样本中白细胞阴性筛选的标志物。（2）基于转录组学结果共筛选到7556个基因在宫颈上皮细胞系和JEG3细胞系之间呈现差异性表达,其中有3757个基因显著上调表达和3799个基因显著下调表达。按照细胞膜表达、表达丰度相对高、有商品化抗体的原则,综合差异表达基因具有的功能,初步筛选出了 CD44、CD227、CD82、CD9、CD49c、CD58、HLA-A共7个有潜力的宫颈上皮细胞标志物。经流式鉴定CD44、CD227在宫颈上皮细胞系及TCC样本中表达明显升高,在JEG3细胞系中无表达或表达很低,符合我们阴性选择母源宫颈上皮细胞的要求。（3）制备细胞比例为0.1%的JEG3细胞+TCT掺入样本,利用负筛+正筛的单克隆抗体的磁珠分选法可将JEG3细胞的比例提高至8.2%,明显高于单纯用耦联有HLA-G抗体阳性选择的磁珠富集效率（0.3%）。（4）本研究中3例样本均为单胎妊娠男胎,我们利用GM12878女性细胞系与GM50166男性细胞系的WGA产物进行低覆盖度测序,根据低覆盖度测序分析结果设置RsrPKMy的阈值来区分性别差异。当RsrPKMy值＞10且覆盖度＞30%时我们可以将候选EVT细胞鉴定为男性胎儿源性,男胎鉴定符合率达100%。（5）我们将低覆盖度测序分析unique map ratio＞30%且覆盖度＞30%的男性胎儿源性细胞定义为高质量的细胞,3例样本分别筛选出7个、7个、6个数据质量较高的细胞用于后续WGS。研究发现EVT细胞WGA-WGS覆盖度最高达为94.15%,3例样本的单细胞在各条染色体上reads的分布情况与对应的脐血gDNA WGS测序结果相比较显示出相似的分布趋势,而且与脐血gDNA在全基因组水平上对SNVs、InDels的检测能力相似,表明经TCC分离的EVT细胞尽可能的复原了胎儿基因组信息。结论我们初步建立的CNPS富集方法可为下游检测提供足量的EVT细胞,基于RsrPKMy的阈值鉴定男性胎儿源性细胞的符合率可达100%。通过对分离的高质量EVT细胞WGA扩增产物进行深度测序分析,其基因组相对完整且覆盖度高,与脐血gDNA在全基因组水平上对SNVs、InDels的检测能力相似,初步表明TCC样本中分离的EVT细胞对单基因疾病的无创产前检测有潜在的临床应用价值。